本发明专利技术提供了用于检测样品中存在的一种或多种核酸靶物的组合物、仪器和方法。本发明专利技术的方法包括：使用2种或更多种寡核苷酸探针，所述探针彼此紧密靠近地可逆地结合靶核酸，并具有互补的反应性连接部分。当这样的探针已经以适当取向结合靶物时，它们能够发生自发的化学连接反应，该反应产生连接的寡核苷酸产物。在一个方面，所述连接产物具有与特定靶物有关的可变长度。在化学连接以后，通过毛细管电泳或微阵列分析，可以放大和检测探针。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用化学连接检测样品中的核酸的组合物和方法。
技术介绍
本专利技术涉及用于检测样品中存在的一种或多种核酸靶物的组合物、仪器和方法。 特定核酸的检测是诊断医学和分子生物学研究的一种重要工具。基因探针测定法目前在下述方面起作用鉴别传染性生物体诸如细菌和病毒、探测正常基因和突变基因的表达以及鉴别与疾病或损伤有关的基因(诸如癌基因)、在组织移植之前分型组织的相容性、匹配用于法医学的组织或血液样品、对紧急响应情形(如核事故或流行性流感暴发)做出响应、测定疾病预后或病因、和探查来自不同物种的基因之间的同源性。理想地，基因探针测定法应当是灵敏的、特异性的和可容易地自动化的(关于综述，参见 Nickerson，Current Opinion in Biotechnology (1993) 4 :48-51)。通过开发聚合酶链式反应(PCR)和允许研究人员在分析之前指数地扩增特定核酸序列的其它扩增技术，已经极大地减轻了对灵敏度(即低检测限)的要求(关于综述，参见Abramson等人， Current Opinion in Biotechnology, (1993)4:41-47)。例如，已经证实，对 SNP 基因座进行多重PCR扩增并随后与寡核苷酸阵列杂交，是同时对数百个SNP进行基因分型的准确的且可靠的方法(参见Wang等人，Science, (1998)280 :1077 ；也参见khafer等人，Nature Biotechnology, (1989) 16 :33-39)。特异性也是许多目前可利用的基因探针测定法的一个问题。探针和靶物之间的分子互补性程度决定了相互作用的特异性。杂交反应中探针、靶物和盐的组成和浓度的变化以及反应温度和探针长度都可以改变探针/靶物相互作用的特异性。在有些情况下，区分具有精确互补性的靶物和具有错配的靶物是可能的，尽管在使用传统技术的情况下这通常是非常困难的，因为反应条件的小变动会改变杂交。对于错配检测具有必要的特异性的更新的技术包括探针消化测定法(其中错配会建立探针切割位点)和DNA连接测定法(其中单点错配会阻止连接)。多种酶的和非酶的方法可用于检测序列变动。基于酶的方法的实例包括 Invader 、寡核苷酸连接测定法(OLA)、单碱基延伸方法、等位基因PCR、和竞争探针分析 (例如通过杂交进行竞争测序)。酶法DNA连接反应是本领域众所周知的(Landegren， Bioessays (1993) 15(11) :761-5 ；Pritchard 等人，Nucleic Acids Res. (1997)25(17) 3403-7 ；mi等人，Genomics，(1989)4(4) :560-9)，且已经广泛地用于SNP检测、酶扩增反应和DNA修复。已经开发了许多非酶的或模板介导的化学连接方法，它们可以用于检测序列变动。这些方法包括化学连接方法，该方法使用偶联剂，诸如N-氰基咪唑、溴化氰、和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)_碳二亚胺氢氯化物。参见Metelev，V. G.，等人，Nucleosides & Nucleotides (1999) 18 :2711 ；Luebke, K. J.，和 Dervan，P. B. J. Am. Chem. Soc. (1989) 111 8733 ；和 Shabarova，Z. A.，等人，Nucleic Acids Research (1991) 19 :4247，它们各自通过引用整体并入本文。Kool (美国专利号7，033，753，它通过引用整体并入本文)描述了化学连接和荧光共振能量转移(FRET)用于检测遗传多态性的应用。在该方法中，读数是基于荧光强度的溶液相变化。Terbrueggen (美国专利申请60/746，897，它通过引用整体并入本文)描述了化学连接方法、组合物和试剂用于通过微阵列检测来检测核酸的应用。其它化学连接方法使5’ -甲苯磺酸酯或5’ -碘代基团与3’ -硫代磷酸酯基团反应，产生用硫替代成桥的磷酸二酯氧原子之一的DNA结构。参见Gryanov， S. Μ.，禾口 Letsinger，R. L.，Nucleic Acids Research(1993) 21:1403 ；Xu, Y.禾口 Kool， Ε.T.Tetrahedron Letters(1997)38 :5595 ；禾口 Xu， Y.禾口 Kool， Ε.Τ. ， Nucleic Acids Research (1999) 27 :875，它们各自通过引用整体并入本文。使用非酶方法进行核酸靶物检测的一些优点包括对非天然的DNA类似物结构的更低灵敏度，能够使用RNA靶序列，在不同条件下更低的成本和更大的稳健性。Letsinger 等人(美国专利号5，780，613，通过引用整体并入本文)以前已经描述了邻近的模板-结合的寡核苷酸的不可逆的、非酶的、共价的自连接(autoligation)，其中一个寡核苷酸具有 5’可取代的基团，另一个寡核苷酸具有3’硫代磷酰基基团。PCT 申请 TO 95/15971、PCT/US96/09769、PCT/US97/09739、PCT US99/01705、 W096/40712和W098/20162 (它们都特别地通过引用整体并入本文)描述了新颖的组合物， 其包含含有电子转移部分的核酸，包括电极，其可以实现新颖的核酸杂交检测方法。已经获得增加的重要性的一种技术包括使用DNA阵列(Marshal 1等人，Nat Biotechnol. (1998) 16(1) :27-31)，特别是对于包括同时测量多种核酸靶物的用途。DNA 阵列最经常用于基因表达监测，其中同时测量1至100，000个核酸靶物(mRNA)的相对浓度。DNA阵列是小装置，其中核酸锚定探针以在生产时就已知的独特方式连接在表面上 (Marshall等人，Nat Biotechnol. (1998) 16(1) :27-31)，或可以在以后准确地译解，诸如在珠子阵列的情况下(Steemers 等人，Nat Biotechnol. (2000) 18(1) :91-4 ；和 Yang 等人， Genome Res. (2001) 11(11) :1888-98.)。在一系列上游处理步骤后，使目标样品接触DNA阵列，样品中的核酸靶物与表面上的锚定寡核苷酸杂交，并测定样品中靶核酸的同一性，且经常测定样品中靶核酸的浓度。许多目前使用的核酸检测方法具有阻碍它们的广泛适用性的特征和/或限制。例如，在DNA微阵列的情况下，在使样品接触微阵列之前，通常必须对样品进行一系列处理步骤。尽管这些步骤随阵列的生产商和/或用于读出阵列的技术(荧光、电化学、化学发光、 磁阻、悬臂梁偏转、表面等离子体共振)而异，这些处理步骤通常归入一些总类别核酸分离和纯化、酶扩增、可检测标记掺入、和扩增后净化。其它常见的步骤是样品浓缩、扩增的靶物片段化(从而减小核酸靶物的平均大小)、和外切核酸酶消化(以将PCR扩增的靶物转化成单链物质)。对于使DNA阵列接触样品之前的许多上游处理步骤的需求，可以显著增加通过这些方法来检测核酸靶物的时间和成本。还对得到的数据的质量具有显著影响。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·特布吕根，
申请(专利权)人：德克斯特里蒂诊断公司，
类型：发明
国别省市：
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