检测混合物中山羊角成分的方法及所用引物技术

本发明专利技术提供了一种检测混合物中山羊角成分的方法及所用引物，所述的方法主要包括：从待测混合物中提取总DNA；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为选自：SEQ?ID?Nos.1和2、SEQ?ID?Nos.3和4、以及SEQ?ID?Nos.5和6中的一对、两对或三对引物；对扩增结果进行分析判断。本发明专利技术进一步提供了包含上述引物的检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂中山羊角成分的试剂盒。本发明专利技术的引物具有较高的特异性和灵敏性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及应用分子生物学技术检测混合物特别是药材中山羊角成分的方法，具体地涉及检测药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂中山羊角成分的方法，以及该方法中所用到的特异性引物。
技术介绍
山羊角为牛科动物青羊、背山羊的角，具有与羚羊角相似的镇痛和解热作用，可作为羚羊角的替代品，其资源丰富，有利于降低成本，保护珍稀动物。但目前对于山羊角的鉴别主要采用传统形态学方法，依赖鉴别人员经验，主观性高，因此需要一种能够准确、有效的鉴别方法。另一方面，脊椎动物线粒体基因组大小为161Λ左右，呈闭合环状结构，在细胞中呈多拷贝形式存在于线粒体中(依细胞类型不同而异)。动物线粒体基因在进化上保守，且遵循严格的母系遗传特性，因此被广泛用于起源进化分析和物种鉴定。在含山羊角成分的混合物例如药材、或者以山羊角入药的中药制剂等的生产加工过程中，山羊角中的部分DNA通常能够保留于其中，因此，混合物中的山羊角成分可以从其携带的DNA检测中获得鉴定。然而，在混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分鉴定的研究技术上，由于混合物中山羊角DNA含量很低，并且含有多种抑制PCR反应的成分，因此，如何能够有效提取其中的DNA是分子生物学技术鉴定山羊角成分的一个关键；同时，含山羊角的混合物特别是中药制剂中通常还具有较多的其它动植物物种，如何设计山羊物种特异性引物也成为鉴定技术的另一关键。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种利用分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法，以准确、有效地鉴别混合物中是否含有山羊角成分。本专利技术的另一目的在于提供一种用于分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法中的特异性引物。本专利技术的另一目的在于提供了一种用于分子生物学技术检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或其替代品入药的中药制剂中山羊角成分的试剂盒，其中包含本专利技术所述的引物。为达上述目的，一方面，本专利技术提供了一种利用分子生物学技术检测混合物中山羊角成分的方法，该方法主要包括从待测混合物中提取总DNA ；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增；对上述扩增结果进行分析判断。如前所述，通常，含山羊角的混合物特别是混合药材、或者以山羊角入药的中药制剂中，山羊角成分含量很低，并还含有较多的其它动植物物种，还可能含有多种抑制PCR反应的成分，在此情况下，设计山羊物种特异性引物是本专利技术的分子生物学检测技术的关键之一。根据本专利技术的具体实施方案，本案专利技术人从山羊角中提取了总DNA，根据NCBI中公布的山羊线粒体DNA与核DNA序列设计引物，经扩增、测序，提交blastn比对、分析等， 设计了本专利技术的山羊特异性引物。所设计的山羊特异性引物为选自如下SEQ ID Nos. 1和 2(本专利技术中亦将该引物对命名为G1F/R)、SEQ ID Nos. 3和4(本专利技术中亦将该引物对命名为G2F/R)、以及SEQ ID Nos. 5和6 (本专利技术中亦将该引物对命名为G3F/R)中的一对、两对或三对引物G1F/R 5' -ACAATAACAGCATTTTC-3，(SEQ ID NO :1)/5，-ATAGACCTCGTCCGATA-3，(SEQ ID NO 2)；G2F/R 5' -ACAGCATTCATAGGCTATGTTT-3，(SEQ ID NO :3)/5，-TTTCGTGGAGGAAGAGC-3，(SEQ ID NO 4)；G3F/R 5' -CGGAGACCCAGACAACTATATC-3，(SEQ ID NO :5)/5，-TGTGGAGGAAGGGTACA-3，(SEQ ID NO :6)。如前所述，通常含山羊角的混合物特别是药材、或者以山羊角入药的中药制剂中山羊角DNA成分的含量是很低的，如何能够有效提取其中的DNA，是本专利技术检测山羊角成分技术的另一个关键。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的方法中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括以下步骤待测混合物经煮沸法处理20 40分钟；加入CTAB提取缓冲液60°C 70°C消化2 4小时；用酚仿法抽提；加入异丙醇沉淀富集DNA ；利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的上述方法特别适合于对以山羊角入药的药材混合物或中药制剂中山羊角总DNA进行提取，即使药材混合物或中药制剂中山羊角成分含量含量低至3wt% (除特别注明外，本专利技术中所述含量与比例均为重量含量与比例)，或是药材或中药制剂中含有其他多种动植物成分(例如，山羊角方或羚羊角方的羚羊清肺丸，含有二十四味药；牛黄清心丸，含有二十九味药；等)，也能有效提取其中的DNA。根据本专利技术的具体实施方案，上述从待测混合物中提取总DNA的过程中所述煮沸法处理待测混合物样品主要是破碎细胞，具体操作时可根据需要向待测混合物中加入适量的水(通常，每3 5g总固含量的待测样品加IOml水)，煮沸通常是可以在常压下进行(100°C左右)，煮沸时间20 40分钟，优选30分钟 40分钟。所述向煮沸后的待测样品中加入CTAB提取缓冲液进行消化处理，主要是破坏混合物中的多糖多酚类物质。根据本专利技术的优选具体实施方案，所用CTAB提取缓冲液的组成为3% CTAB，IOOmM Tris-HCl pH 8. 0,20mM EDTA pH 8. 0,2. 5M NaCl。最优选的消化处理条件为等体积混合，65 °C，3小时。所述酚仿法抽提主要是去除混合物中蛋白质、色素等溶于有机物的杂质。酚仿法抽提的具体操作可以按照所属领域的常规操作进行。根据本专利技术的优选实施方案，本专利技术中所述酚仿法抽提的操作为经CTAB缓冲液消化后的样品冷却至室温后加入等体积苯酚/ 氯仿/异戊醇05 24 1)，混勻，12000rpm离心20分钟，取上清；再加入等体积氯仿/ 异戊醇04 1)，混勻，12000rpm离心20分钟，取上清。本专利技术中，向上述经酚仿法抽提得到的上清中加入异丙醇主要是沉淀富集DNA。根据本专利技术的优选实施方案，具体操作为加入等体积预冷的异丙醇，混勻，4°C 12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%酒精洗涤。为便于后续纯化步骤，可将洗涤后的提取物用适量双蒸水溶解。所述利用PCR纯化试剂盒进行纯化的步骤主要是去除DNA中残留的色素等水溶性杂质。PCR纯化试剂盒可以采用所属领域常用的商购产品，具体操作可以按照纯化试剂盒的说明书进行。根据本专利技术的具体实施方案，当待测混合物中含有较多多糖类物质时，在提取总 DNA的过程中，在经酚仿法抽提得到的上清中，还可加入LiCl过夜处理，以去除残留多糖类物质，之后再加入异丙醇沉淀富集DNA。此外，对于利用PCR纯化试剂盒所纯化得到的总 DNA，还可进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取情况。在本专利技术的一具体实施方案中，所述的待测混合物为以山羊角或其替代品(例如黄羊角或其他物种伪品)入药的中药制剂或混合药材，其中除山羊角或其替代品外，还含有其他多种动植物成分，例如，羚羊清肺丸含有二十四味药，牛黄清心丸含有二十九味药等，本专利技术的方法是用于检测该中药制剂或混合药材中是否是真正以山羊角入药。在该具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测混合物中山羊角成分的方法，该方法主要包括 从待测混合物中提取总DNA ；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为选自SEQ ID Nos. 1和2、SEQ ID Nos. 3和4、以及SEQ ID Nos. 5和6中的一对、两对或三对引物； 对上述扩增结果进行分析判断。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括如下步骤待测混合物经煮沸法处理20 40分钟； 加入CTAB提取缓冲液60V 70°C消化2 4小时； 用酚仿法抽提； 加入异丙醇沉淀富集DNA;利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述PCR扩增反应条件如下反应体系为15 μ 1，其中10XPCR缓冲液1 5. 5 μ l,dNTPs (2. 5mM)0. 5 1. 8μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 0. 5 1. 5 μ l，Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1)0. 2 1. 2 μ 1，DNA 模板(50ng/ μ 1)0. 8 3μ 1，无菌超纯水补至15μ 1 ；扩增条件95°C预变性5min ；95°C变性30s，48 68°C退火30s, 72°C延伸30s，35 40 个循环；最后72°C延伸7 IOmin ；优选地，所述SEQ ID Nos. 1和2的退火温度为52°C，所述S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志猛，曹梦，姚璐，彭鹏，张晓楠，张丽娟，
申请(专利权)人：北京同仁堂股份有限公司，北京同仁堂科技发展股份有限公司，北京中研同仁堂医药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：