本发明专利技术提供使用用于改变花色的有用的转录调控区域并通过基因重组技术在菊花植物或除菊花以外的植物中控制类黄酮合成系统的方法、修饰花色素苷的方法、生产在花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物或除菊花以外的植物的方法、及导入了该调控区域的菊花植物或除菊花以外的植物、或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织。本发明专利技术所涉及的方法中，使用紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域，例如含有序列号1所示的碱基序列的核酸，或使用三色堇F3’5’H基因的转录调控区域，例如包含含有序列号15所示碱基序列的核酸的表达载体或表达盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶(3AT)基因而在菊花植物中控制类黄酮生物合成系统的方法、修饰花色素苷的方法、及导入该基因的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。本专利技术还涉及来自三色堇的类黄酮3'，5'-羟化酶(以下也称为F3' 5' H)基因#40(以下也称为BP40。)的转录调控区域及其使用。
技术介绍
通过利用基因重组技术，使有用的基因在目的植物中表达，可将新的性状赋予该植物。如此制作的基因重组植物已被大范围栽培。基因表达的调控主要在转录阶段进行控制，所以转录调控在调控基因表达上最为重要。即为制作产业上有用的基因重组植物，在适当时期、用适当组织、以适当强度转录非常重要。转录在很多情况下通过位于转录区域的5’ 侧的DNA序列来控制。将确定基因转录的起始位点、直接调控其频率的DNA上的区域称为启动子。启动子有时存在于起始密码子的5’侧数十bp处，多含有TATA盒等的序列。其还在 5’侧具有结合各种转录调控因子的顺式作用元件，这些顺式作用元件的存在控制着转录的时期、进行转录的组织、转录的强度。转录调控因子根据氨基酸序列的不同分为很多家族。 例如，Myb型转录调控因子、bHLH(碱性/螺旋-环-螺旋(basic helix loop helix))型转录调控因子等是有名的家族。实际上，很多情况下，转录控制区域与启动子在同样意义上使用。作为花的颜色的主要成分的花色素苷为总称为类黄酮的次级代谢产物之一。花色素苷的颜色依赖于其结构。即作为花色素苷的发色团的花色素B环的羟基数增加时颜色变蓝。且还已知修饰花色素苷的芳香族酰基(香豆酰基、咖啡酰基等)的数量增加时，花色素苷的颜色变蓝(即最大吸收波长向长波长移动)，花色素苷的稳定性增加(以下参照非专利文献1)。与花色素苷的生物合成有关的酶及编码该酶的基因被广泛研究(参照相同非专利文献1)。例如，催化向花色素苷转移芳香族酰基的反应的酶基因可从龙胆、薰衣草、矮牵牛等中获得(以下参照专利文献1、专利文献2)。与红紫苏叶中积累的花色素苷(丙二酰基紫苏宁、3-0- (6-0- (E) -ρ-香豆酰基-β -D-吡喃葡萄糖基)-5-0- (6-0-丙二酰基-β -D-glucopyranosyl)-花青素(3-0- (6-0- (E) -p-coumaroyl- β -D-glucopyranosyl) -5-0- (6-0-malonyl- β -D-glucopyranosyl) -cyanidin))(以下参照非专利文献 2)的合成有关的酶基因以羟基肉桂酰辅酶A 花色素苷3葡萄糖苷-芳香族酰基转移酶(3AT)的基因 {以下简称“紫苏花色素苷3-酰基转移酶(3AT)基因”。}为代表已有报道(参照相同专利文献1)。而且也获得了关于花色素苷的生物合成酶基因转录控制(调控)的知识和见解。 这些基因的位于起始密码子5’侧的转录调控区域中，具有Myb型转录调控因子、bHLH型转录调控因子结合的顺式作用元件序列。还已知Myb型转录调控因子和bHLH型转录调控因子控制矮牵牛、玉米、紫苏等的花色素苷的合成(参照相同非专利文献1)。在植物中负责基因转录的启动子(以下称转录调控区域)中，有无论在何种组织或发育阶段的何种时期均发挥功能的所谓组成型启动子、和仅在特定器官·组织中发挥功能的器官·组织特异性启动子、及仅在发育阶段的特定时期表达的时期特异性启动子。作为用于使有用基因在基因重组植物中表达的启动子，常用的是组成型启动子。作为代表性的组成型启动子，有花椰菜花叶病毒35S (以下也称为CaMV35Q启动子、以此为基础构建的启动子(以下参照非专利文献3)、Macl启动子(以下参照非专利文献4)等。但是，在植物中，很多基因均为组织·器官特异性或时期特异性表达。这说明使基因进行组织·器官特异性或时期特异性表达对植物来说是必需的。有利用此种组织 器官特异性或时期特异性的转录调控区域进行植物的基因重组的例子。例如，有使用种子特异性的转录调控区域使蛋白质在种中积累的例子。但是，植物虽可开出多种颜色的花，但由于种所具有的遗传性限制，所以能开出所有颜色的花的种很少。例如，在月季、康乃馨等中，自然界中不存在能开蓝色、紫色花的品种。原因是月季、康乃馨不具有用于合成许多开蓝色、紫色花的种所合成的称为花翠素的花色素时所必需的F3’ 5’ H基因。通过在这些种中导入作为开蓝色、紫色花的种的矮牵牛、三色堇等的F3’ 5’ H基因，可使这些种的花色变蓝。为康乃馨的情况下，为使来自不同种的 F3’ 5’ H基因转录，使用来自金鱼草或矮牵牛的查耳酮合成酶基因的转录调控区域。例如， 作为包含来自金鱼草或矮牵牛的查耳酮合成酶基因的转录调控区域的质粒，可例举以下专利文献3中记载的质粒pCGP485、pCGP653，作为包含组成型转录调控区域的质粒，可例举质粒pCGP6^ (包含Macl启动子)、以下专利文献4中记载的质粒pSPB130 (包含附加有增强子的CaMV35S启动子)。但是，很难预测这样的启动子在重组植物中可在何种程度上发挥作用，是否可带来目的表达型。且为使复数的外源基因表达而反复使用相同启动子有时会引起基因的沉默，所以应考虑避免(以下参照非专利文献5)。因此，虽然一些启动子被用于改变花的颜色，但还进一步需要与目的宿主植物的目的相符合的有用的启动子。特别是菊花植物(也简称“菊花”。)约占日本全国批发价格(农林水产省统计的平成19年花卉批发市场调查结果概要)中的30%，与月季约占9%、康乃馨约占7%相比， 可见其重要性。菊花中虽有白色 黄色 橙色 红色 粉色 紫红色等的花色，但还没有紫色、蓝色等蓝色系的花色。因此，蓝色系的育种成为用于唤起新需求的目标之一。菊花的花色通过花色素苷和类胡萝卜素的组合来体现。花色素苷由于作为基本骨架的花色素的结构不同、通过糖、有机酸而进行的修饰的不同等，可出现多种颜色。但是，已知负责菊花花色的花色素苷仅有花青素的3位被葡萄糖和丙二酸修饰的两种即cyanidin 3-0-(6" -0-monom alonyl-β -glucopyranoside 禾口 cyanidin 3-0-(3 “ ,6 “ -Ο-dimalonyl-β -glucop yran0Side(以下参照非专利文献6)。且其结构比较单纯(参照图1)。由于上述原因，菊花的花色素苷成为使显色范围极小的主要原因。如上所述，菊花在日本是最重要的花卉，但因具有六倍体这样的多倍性，且基因组尺寸大，所以不仅转化效率低，还会引起导入基因的沉默(钝化)，因而不易得到稳定表达导入基因的基因重组菊花。有如下报道，导入连接在CaMV35S启动子上的β-葡萄糖醛酸酶 (⑶S)基因的菊花与导入相同基因的烟草相比，⑶S基因的活性为10分之1左右，且在转化5后经过12个月以后，在几乎所有的个体中其活性均降低(以下参照非专利文献7)。有报道指出，已经得到了用于使外源基因在菊花中稳定表达的编码在菊花中发挥良好功能的叶绿素a/b结合蛋白质的基因的启动子，但该启动子不适合使基因在基本不存在叶绿素的花瓣中表达(以下参照非专利文献8)。还有如下报道，将连接在烟草的延伸因子(elongation factor) 1 (EF本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：野田尚信，间竜太郎，佐藤早苗，大宫明美，田中良和，
申请(专利权)人：三得利控股株式会社，
类型：发明
国别省市：
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