吸附剂及精制方法技术

在本发明专利技术涉及一种用于亲合色谱分离的特殊吸附剂，该特殊吸附剂中的配位体为葡糖基糖苷类，低聚葡糖基糖糖苷类或其混合物。本发明专利技术还涉及一种用所述的特殊吸附剂进行亲合色谱分离和精制的方法。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，特别涉及一种用于亲合色谱分离的特殊吸附剂，以及使用该特殊吸附剂进行亲合色谱分离精制的方法。本专利技术是关于利用亲合色谱有效地和高纯度地精制β-淀粉酶、麦芽低聚糖生成酶等与糖类有关的酶。在含有生物体物质的各种领域中，亲合色谱被用来对生物体进行分离、精制及定量分析，特别是用其解释生物体之间的特殊的相互作用机能。亲合色谱的分离精制是利用具有亲合力的二种物质(A及B)间的相互作用，使一种物质(A)以配位体形式与不溶性载体结合、固定，并从含有多种物质的混合液中只选择性地吸收结合另一种物质(B)，然后，通过取出物质B，而达到分离精制B的目的。对于α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等，可以利用淀粉、多缩葡萄糖及这些物质的各种衍生物(交联葡聚糖类等，以下称“来自淀粉物质”)作为吸附剂，利用亲合色谱进行分离精制。将亲合色谱应用于工业精制的时候，对于来自淀粉物质的单位重量的吸附剂要求尽量吸附大量的酶;若应用于实验室的精制时，还有必要在提高精制淀粉酶的纯度上下一番功夫。可是，目前在工业规模上需要纯度高的酶，并还需要高纯度地分离精制大量的目的产物。使用上述来自淀粉物质作为吸附剂的亲合力色谱是不能满足这些要求的。鉴于以上的现状，本专利技术的目的是在利用亲合色谱对有关的糖类酶进行分离精制时，提供了一种特殊的吸附剂以及高纯度地精制大量目的产物的方法。本专利技术者们经过锐意的研究，结果发现了使用葡糖基糖苷(Glucosyl Moranolines)类、低聚葡糖基糖苷(Oligo-glucosyl Moranolines)类或者其混合物(以下总称为“葡糖基糖苷类等”)作为亲合色谱的配位体一举解决了上述的课题，完成了本专利技术。本专利技术的要旨就在于以葡糖基糖苷类作为配位体。本专利技术提供了一种具有配位体的特殊的吸附剂、以及使用这种特殊的吸附剂的亲合色谱精制法。在本专利技术中的以葡糖基糖苷类等作为亲合色谱的配位体的特殊吸附剂在此之前没有任何报导，所以本专利技术方法是一种新方法。另外，关于麦芽三糖生成酶用亲合色谱进行分离在此之前也没有成功例，通过本专利技术才得的实现。以下对本专利技术进行详细描述。本专利技术的特殊吸附剂是由配位体及不溶性载体而构成的。本专利技术的特殊吸附剂，可以含有作为构成要素的间隔基(Spacer)。本专利技术的配位体是葡糖基糖苷类。通过它们可以达到本专利技术的特有效果。此外，所谓的葡糖基糖苷类是指糖苷(Moranoline)、N-取代糖苷等的糖苷衍生物的葡糖基物质或低聚葡糖基物质。本专利技术的葡糖基糖苷类没有特殊的限制，但其代表例如下，即用通式表示的化合物。 式中，n表示0～30的整数。R表示氢、烷基、苯基烷基、苯基烯基、苯基炔基、苯氧烷基、苯氧烯基、苯氧炔基等。上述R，作为其构造的一部分含有烷基时，其烷基是直链或支链的，可有不饱和键，也可以有氨基、亚氨基、羟基、烷氧基、羰基或羧基等官能基。或者上述的R，作为其结构的一部分含有苯基时，该苯基也可以用氨基、亚氨基、羟基、烷氧基、羰基或羧基等官能基所取代。在本专利技术中，对所谓的间隔基没有特别的限定，它是使不溶性载体和配位体相结合的(或者是夹在两者的中间)构成要素。间隔基具有二官能基时，通过一个官能基与不溶性载体结合，通过另一个官能基与配位体结合理，这二个官能基可以相同，也可以不同。另外也可以是二个以上的间隔基化合物结合后，构成间隔基的一部分。本专利技术中，将葡糖基糖苷类等作为配位体制作亲合色谱分离用的特殊吸附剂的方法，可以采用公知的一般制法。这些一般方法已记载在很多的的文献、或各种报告中(例如，千烟一郎亲合色谱分离法、讲座报告。山峙诚等亲合色谱分离法，讲座报告)。本专利技术中的所谓与糖类有关的酶可举出，多糖类的分解及生成的酶，例如，α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、麦芽低聚糖生成的淀粉酶(麦芽三糖生成的淀粉酶、麦芽四糖生成的淀粉酶、麦芽五糖生成的淀粉酶等)、环糊精葡糖基转移酶等。本专利技术的特征是在于作为亲合色谱中最重要的构成要素-配位体是使用了葡糖基糖苷类等。本专利技术的特殊吸附剂中，对于不溶性载体及间隔基没有特别的限制，可以使用已广泛使用的适当物质。作为这些不溶性载体，可举出有纤维素、琼脂糖、交联多缩葡萄糖、交联聚丙烯酰胺、多孔性硅珠等。本专利技术的特殊吸附剂，可按通常的方法制造。可成为间隔基化合物的具有二官能基化合物的例子如下，例如可将1，4-丁二醇二缩水甘油醚等直接与琼脂糖凝胶等的琼脂糖系不溶性载体反应，通过洗涤除去过剩的环氧乙烷后，与本专利技术的葡糖基糖苷类进行反应而得到。此时，可在0.5N的氢氧化钠溶液中加入琼脂糖凝胶、环氧乙烷，在室温下使不溶性载体反应约10小时，水洗后，同样使其与葡糖基糖苷类反应来制备的。对于本专利技术的与糖类有关的酶的精制方法，除了使用本专利技术的亲合色谱用的特殊的吸附剂之外，不用采用其他特别方法也可以实施。例如，将本专利技术的特殊吸附剂充填到柱中，流过适当溶液(通常为缓冲液)后，再流过适当溶液(通常为缓冲液)，洗脱出非吸附物质后，再流过含有可以吸附从吸附剂中游离出的酶的物质(通常为基体或基体类似物质)的溶液，就可以得到所要求的酶。实施例以下通过本专利技术的参考例及实施例进一步详细说明本专利技术。参考例1 麦芽三糖生成酶的活性测定麦芽三糖生成酶(以下称为“G3酶”)的活性测定使用了DNS(二硝基水杨酸)法。在400μ12%可溶性淀粉中加入100μ1G3酶、在40℃恒温10分钟后，加入1ml DNS，沸腾5分钟。水冷后，加入4.5ml水、测定其在535nm的吸光度。另外将在1分钟内生成1微摩尔的麦芽三糖的酶量作为1U。蛋白质是通过测定在280nm的吸光度或者使用测定生物吸收量(biorad)的仪器测定在595nm的吸光度来完成的。参考例2 G3酶产生菌的培养培养基的组成 多缩葡萄糖 3%大豆粉 2%酵母浸汁 0.1%多胨 0.1%磷酸钾 0.3%氯化钙 0.5%硫酸铵 0.1%在上述的培养基中接种连霉菌属·griseus NA-468(Streptomyces griseus NA-468)微工研菌寄存第2227号)，在pH为7、27℃振荡培养4天。参考例3 粗G3酶的制备将上述培养液离心分离(3000rpm、10分钟)，向得到的离心分离上清液中加入硫酸铵使之达到40%饱和程度后，再进行离心分离(10000rpm、10分钟)，向上清液中加入硫酸铵使之达到60%饱和程度。进行离心分离(10000rpm、10分钟)、将沉淀溶解在0.5M醋酸缓冲液(pH5.8)中后，放进透析膜内，使用0.01M醋酸(pH5.8)作为外液进行透析。将其离心分离上清液作为粗G3酶溶液。参考例4 环氧活性化琼脂糖凝胶6B的制备将抽吸干燥的琼脂糖凝胶6B(PHARMASIA社制)10g悬浮在10ml的0.6N氢氧化钠水溶液中，加入10ml 1，4-丁二醇醚，在25℃下，轻微振荡8小时。在玻璃过滤器上充分进行水洗，这样就得到环氧活性化琼脂糖凝胶6B。参考例5 4-O-α-D-吡喃葡糖基糖苷的制备按照江连等在(Y，Ezure Agnic，Biol，chem，491 2159(1985))中描述的方法调制。以下把4-O-α-D-吡喃葡糖基糖苷简本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亲合色谱分离用的特殊吸附剂，其特征在于所述的特殊吸附剂中的配位体是葡糖基糖苷类、低聚葡糖基糖苷类、或其混合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：丸尾重昭，小川博嗣，江连洋治，
申请(专利权)人：日本新药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]