从胚珠进行麻风树的体细胞胚发生制造技术

本发明专利技术涉及体细胞胚产生领域，具体涉及从胚珠进行麻风树的体细胞胚发生的方法。更具体地，本发明专利技术涉及从未开放花芽胚珠进行麻风树的体细胞胚发生的方法和培养基组合物。该方法非常适合麻风树转化，用于成批产生麻风树无性营养繁殖苗，用于产生单倍体、双单倍体、二倍体和无病小植株。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从胚珠进行麻风树的体细胞胚发生专利技术背景本专利技术涉及体细胞胚胎产生领域，尤其涉及一种从胚珠进行麻风树(Jatropha) 的体细胞胚发生的方法。更具体地，本专利技术涉及一种从未开放花芽胚珠进行麻风树 (Jatropha curcas)的体细胞胚发生的方法和培养基组合物。该方法非常适于麻风树转化和产生克隆营养繁殖苗用于大规模麻风树种植，以及用于产生单倍体、双单倍体、二倍体和无病小植株。本文中使用的举例说明本专利技术背景或者提供额外关于实施的详细描述的出版物及其他材料援引加入本文，为方便起见分别附于参考文献中麻风树属于大戟科植物，原产拉丁美洲，广泛分布于世界热带干旱与半干旱地区。麻风树大属包含170种以上。印度最普通的品种是麻风树、有腺麻疯树 (J. glandulifera)、棉叶麻风树(J. gossypifolia)、珊瑚花(J. multifida)、J. nana、琴叶珊瑚(J.panduraefolia)、J. villosa和佛肚树(J. podagrica)。麻风树是一种带有灰色光滑树皮、切开渗出白色水状液汁的小树或灌木。通常生长到3至5米高之间，但是在适宜条件下高度可以达到8或10米。它是耐干旱植物，在边缘土地生长存活达50年。麻风树(Jatropha curcas)叶深绿色至淡绿色，交互对生。螺旋叶序列，3 5浅裂。花柄长6-23mm。花期热季。在湿度适宜和高温土壤中获得几次收获。在这种出现连续生长的条件下，雌或雄花产生的不平衡导致大量雌花。当冬季灌木无叶的时候产生果实。 每个花序产生一串大约十个或十个以上的卵形果实。种子成熟并且肉质外果皮变干以后产生带有三个双瓣的小干果。受精二到四个月后荚膜从绿色变为黄色的时候种子成熟。黑色的薄壳种子是椭圆形类似小蓖麻种子。这种植物具有多种的医药应用，特别是在营养制品、 药品、皮肤病和个人护理产品方面。麻风树(Jatrophacurcas)由于存在称作“麻风树碱”的生物碱，其汁液具有抗癌特性。嫩枝用于清洁牙齿。叶子汁应用于外用治疗痔疮。根用作蛇咬的解毒药。种子用于驱虫目的。树皮产生的深蓝色染料可以用于布、鱼网和线的染色。 除了产油品种J. curcas和J. glandulifera，大多数麻风树品种是用于观赏的。这些品种种子包含半干性油，已经发现有助于医药和兽医目的。种子中含油量是25-30%，核中50-60 %。油含有21 %的饱和脂肪酸和79%的不饱和脂肪酸。麻风树油包含亚麻酸(C18:2)和油酸(C18:l)，其总量达到油组分的80%。油中的其它脂肪酸是棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)。这种油是不可食用的，但是它可能提供一种有前途的有商业价值的柴油替代物，因为它具有柴油的所有合乎需要的物理化学和性能特性。植物J. curcas目前作为一种热带能源植物受到特别关注。因为种子油具有接近矿物燃料柴油的特性，因此可用作柴油动力燃料。此外由于它无毒和可生物降解的特性，麻风树生物柴油符合柴油发动机用纯的和混合的汽车燃料的欧洲EW4214标准。麻风树(Jatropha curcas)种子产量接近6_8MT/ha，带有大约37%的油。这种产量相当于能生产2100-2800升燃料油/ha，其能量相当于19800_26400kwh/ha (Gaydou等，1982)。因为其非常高的皂化值和无烟燃烧的性能，种子油具有商业用途。例如，广泛用于制造香皂。目前全世界对经济、环境和能源安全的担忧促使从矿物燃料向生物燃料替代物如生物乙醇和生物柴油的转变。由于生物燃料能从 多种作物产生，每个国家采取策略开发所拥有作物的比较优势。不同生物燃料作物中，Jatropha curcas由于生理和天然因素被认为是生产生物燃料的更好选择。对麻风树的油料的强烈兴趣对供应足够种植用的均质及高产种子已产生巨大压力。因此，目前急需大量繁殖精选树。同等急需的是改良麻风树的各种农学性状的方法。基因工程被认为是作物改良的快速方法。植物转化基本上是两步方法，即输送基因进入宿主细胞，随后再生转化细胞为植物。体细胞胚性愈伤组织或者体细胞胚发生悬浮培养物通常被认为是最有效的再生方法，因为大多数转化细胞已获得胚发生潜力，能非常自发地驱动它们发展为体细胞胚，这是类似于合子胚中的受精卵细胞的过程(Dodeman等， 1997)。体细胞胚适于经根癌农杆菌(Agrobacterium tuniefaciens) (Mathews等，1992)、 显微注射(Neuhaus等，1987)和颗粒轰击(Wilde等，1992)转化。另外，体细胞胚或体细胞胚性愈伤组织可以用液氮冷冻保存而不丧失活性。因此它们是保持种质及细胞胚发生的理想材料。体细胞胚在来源上是克隆的，因此用体细胞胚增殖可以具有非常高的无性增加速率的潜力，并因此有显著商业价值。经体细胞胚发生的再生是植物组织培养的有吸引力的选择。体细胞胚据报道提供比茎叶(Shoot)更稳定的再生体(regenerant)。使用体细胞胚的再生系统的另一个优势是它们的明显单细胞来源。这意味着再生体不太可能是嵌合来源的，因为如果再生体源自一簇细胞而非单细胞，则植物组织可能是嵌合的或者不稳定的并且产生非正常型(off-type)。为了进一步改良该作物，可以利用诸如组织培养和转化的生物技术。20多年中， 几份研究记录了使用各种外植体使用不同培养基组合物的麻风树再生。这些研究包括经由下胚轴、叶柄和叶子外植体(Sujatha和Mukta，1996)、上胚轴外植体(中国专利申请号 200610020449. X)、叶盘(印度专利申请公开号490/MUM/2006)、茎尖和节外植体(欧洲专利申请公开号1817956 ；Datta等，2007)、叶愈伤组织的体细胞胚发生(Jha等，2007)和子叶盘外植体转化(Li等，2008)的植物再生。上述所有研究集中在愈伤组织介导和分生组织再生。经由生殖组织(花药或胚珠)器官发生或体细胞胚发生的小植株产生能引起产生单倍体、双单倍体或二倍体，其可产生典型的纯合特征，使该方法比植物育种计划有利。倍数性检测通常通过计算染色的根尖上的染色体进行，但是这种方法费劲，对具有小染色体和高倍数水平的品种常常很艰难，还会引起对种质错误分类(Brummer等， 1999)。所有染色体位于植物细胞核中，使得核DNA含量能够用于测定倍数性水平。最近几年，由于流式细胞仪的容易、快速和准确，已变成测定核DNA含量的优选技术(Rayburn等， 1989 ；HesIop-Harrison, 1995) Arumuganathan 和 Earle (1991a)使用流式细胞仪测定了超过100种主要农作物品种的核DNA含量。Vogel等(1999)使用流式细胞仪测定多年生小麦染色体组的基础DNA含量。流式细胞仪也用于测定柳枝稷(Panicum virgatum L.) (Hultquist 等，1997 ；Lu 等，1998)、紫花苜蓿(Medicago sativa L.) (Brummer 等，1999)禾口草皮草种(Arumuganathan等，1999)的倍数性水平。植物细胞中的DNA数量用皮克(pg)表示成“C”值(Bennett和Smith，1976)。字母C表示单倍本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种经由体细胞胚发生再生麻风树的方法，包括步骤：（ａ）在包括ＭＳ基本培养基和２，４－二氯苯氧基乙酸（２，４－Ｄ）的第一培养基中暗培养麻风树外植体，以诱导形成胚性愈伤组织，其中麻风树外植体是切开的未开放花芽的胚珠；（ｂ）在所述第一培养基中在光／暗光周期培养所述胚性愈伤组织，以诱导体细胞胚发育和成熟；和（ｃ）在包括ＭＳ基本培养基、吲哚丁酸（ＩＢＡ）和赤霉酸（ＧＡ３）的第二培养基中在光／暗光周期培养成熟的体细胞胚，以萌发小植株。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/082,8962008年7月23日的上下文中)中，术语“一”、“所述”和类似词语应理解包括单数和复数。除非另外提到，否则术语“包括”、“具有”、“含有”、“包含”被认为是开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)。 文中数值范围的列举仅仅是充当范围内每个单独数值一个一个提到的简写方法，除非特别指出，否则每个单独值并入说明书，如同一个一个在此提到。例如，如果公开了范围10-15， 那么11、12、13和14也被公开了。除非特别指出或者上下文明确相反，否则文中描述的所有方法能以任何适宜顺序进行。任何实施例的使用，或者文中提供的举例语言(例如“诸如”)，除非文中要求保护，否则仅仅为了更好说明本发明，并不限制本发明范围。说明书语言不应解释为指定对于本发明实践关键的任何未要求元素。[0073]应意识到本发明的方法和组合物包括各种形式的实施方案，本文仅仅公幵了一小部分。本发明文中描述的实施方案包括本发明人已知的实施本发明的最好方式。本领域普通技术人员在阅读以上描述的基础上可显而易见实施方案的变化。本发明人期望技术人员可以适当应用这些改变，且可以本文所述不同的方式实施本发明。相应地，本发明包括适用法律允许的在所附权利要求中所述主题的所有修改和等价物。此外，除非特别指出或者上下文明确相反，则上述元素的所有可能范围内的任意变化组合均包含在本发明内。参考文献 Arumuganathan，K. and Earle，Ε. D. (1991a). Nuclear DNA content of some importantplant species. Plant Mol Biol Rep 9:208-219，(1991a).Arumuganathan，K.and Earle, E. D. (1991b). Estimation of nuclear DNA content ofplants by flow cytometry. Plant Mol Biol Rep 9:221—231.Arumuganathan，K. et al. (1999). Nuclear DNA content of thirteen turfgrass species byflow cytometry. Crop Sci 39:1202—1207·Bennett，M. D. et al. (2000). Nuclear DNA amounts in angiosperms and their modernuses-807 new estimates. Ann Bot(London) 86 859~909..Bossoutrot,D. and Hosemans,D. (1985). Gynogenesis in Beta vulgaris Lfrom invitro culture of unpollinated ovules to production of doubled haploid plants in soil. PlantCell Rep 4:300—303.Brummer, E. C. et al. (1999). Ploidy determination of alfalfa germplasm accessionusing flow cytometry. Crop Sci 39:1202-1207·Christen sen，A. H. and Quail，P· H，(1989). Sequence analysis and transcriptionalregulation by heat sho ck of polyubiquitin transcripts from maize. Plant Mol Bioll2 :619_632.Christensen，A. H. et al. (1992). Maize polyubiquitin genes :structure， thermalperturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation. Plant Mol Biol 18:675—689·Datta，M. M. et al. (2007). In vitro clonal propagation of biodiesel plant (Jatrophacurcas L.). Curr Sci 93 1438-1442.Dodeman, V. L. et al. (1997). Zygotic embryogenesis versus somatic embryogenesis. J Exp Bot 48 :1493_1509.Galatowitsch, M. W. and Smith G. A. (1990). Regeneration from unfertilized ovulecallus of sugar beet (Beta vulgaris L.). Can. J. Plant Sci 70 :83-89.Gaydou, A. M. et al. (1982). Vegetable energy sources in Madagascar ethyl alcohol andoil seeds (French). Oleagineux 37:135-141.Giire 1, E· and Giirel, S. (1998). Plant regeneration from unfertilized ovaries of sugarbeet (Beta vulgaris L. ) cultured in vitro.Tr J Botany 22 233-238.Heslop-Harrison, J. S. (1995). Flow cytometry and genome analysis. Probe 5: 14-17.[0089]Hultquist，S. J. et al. (199 7). DNA content and chloroplast DNA polymorphisimsamong accessions of switchgrass from remnant Midwestern prairies. Crop Sci 37 :595_98.Jha, T.B.et al. (2007). Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Lin. , an importantbiofuel plant. Plant Biotech Rep 1 :135_140.Kim, Y. S. et al. (2007). High frequency plant regeneration via somatic embryogenesis in Podophyllum peltatum L ， an important source of anticancer drug. Curr Sci 92 :662_666.Last,D. I. et al. (1991). pEmu :an improved promoter for gene expression in cerealcells. Theor Appl Genet 81 :581_588.Li，M· et al. (2008). Establishment of an mediated cotyledon disc transformationmethod for Jatropha curcas.Plant Cell Tiss and Org Cult 92 173-181.Lu,K. et al. (1998). Nuclear DNA content and chromosome numbers in switch grass. Great Plains Res 8 :269_80·Mathews, H. et al. (1992). Stable integration and expression of beta-glucuronidase andNPT—II genes in mango somatic embryos.In Vitro Cell Develop Biol-Plant 28P :172_178.McElroyiD. et al. (1990). Isolation of an efficient actin promoter for use in ricetransformation. Plant Cell 2 :163_17LMetwally, Ε.I.et al. (1998).Production of haploid plants from in vitro culture ofunpollinated ovules of cucubita pepo. Plant Cell Tiss Org Cult 52 117-121.Murashige，T. and Skoog，F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15:473—497·Neuhaus，G· et al. (1987). Transgenic rapeseed plants obtained by microinjected DNAinto microspore-derived embryoids. Theor Appl Genet 75 :30_36.Odell，J. T. et al. (1985). Identification of DNA sequences ...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·A·瓦苏德万，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：SG