【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术通常涉及高纯度质粒组合物及其制备方法，所述组合物具有低的，或者不可检测的荚膜异多糖酸及其他污染物的水平。也描述了在该方法中的有用的多肽。在此描述的方法及组合物具有一系列的用途，包括在生物恐怖主义、环境科学、食品科学、法医学、 分子生物学以及健康和医学领域内的各种应用。在将核酸引入生物体的任何应用中，关键的步骤是制造高度纯化的，通常是药物级别的核酸。该纯化的核酸必须满足安全性、能力及效力的药物质量标准。此外，期待有可放大的方法，其能够用于产生多克的量的DNA。因此，期待有生产高纯度核酸的方法，其不需要有毒的化学品、诱变剂、有机溶剂或其他危害所得的核酸的安全性或效力的试剂，或者使得扩大规模困难或者不可行。也期待制备不含有污染性内毒素的核酸，所述内毒素若给予患者会引起毒性反应。污染性内毒素的去除是尤其地重要的，例如，自革兰氏阴性(_)细菌来源中纯化的质粒DNA具有高水平的内毒素及荚膜异多糖酸，后者为细胞外膜的必须组分。质粒是自我复制的遗传性元素，其在宿主细菌中存在及复制。从本质上，涉及特定 DNA片段操作的所有分子遗传学方法都使用质粒DNA制造大量的特定的DNA片段(或者得自所述片段的蛋白质/RNA)。细菌宿主的选择，或质粒的来源通常反应了历史上的观点。Stanley Cohen及Herb Bayer选择了大肠杆菌(E. Coli)的K-12株用于其1970年代初期的开创性的分子遗传学实验，由于其容易培养并对于代谢研究而言容易控制。这些相同的性质也使得大肠杆菌Κ-12 成为用于细菌遗传学研究的首选的微生物。分子生物学家现在使用相同株的大肠杆菌用于...
【技术保护点】
１．一种革兰氏阴性细菌质粒组合物，其包含革兰氏阴性细菌质粒ＤＮＡ以及少于约０．１ｍｇ每毫克革兰氏阴性细菌质粒ＤＮＡ的荚膜异多糖酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/125,9162008年4月30日1.一种革兰氏阴性细菌质粒组合物，其包含革兰氏阴性细菌质粒DNA以及少于约 0. Img每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。2.权利要求1的组合物，其中，所述组合物包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸。3.权利要求1或2的组合物，其中，所述组合物不包含可检测的荚膜异多糖酸。4.权利要求1的组合物，其中，通过二喹啉甲酸(BCA)测试测量，所述组合物不包含可检测的荚膜异多糖酸。5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中，所述组合物进一步包含少于约0.Img每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中，所述组合物进一步包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。7.权利要求1-5中任一项的组合物，其中，所述组合物不包含可检测的糖醛酸。8.权利要求1-5中任一项的组合物，其中，通过糖醛酸测试测量，所述组合物不包含可检测的糖醛酸。9.权利要求1-8中任一项的组合物，其中，所述组合物进一步包含少于约0.Img每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中，所述组合物进一步包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。11.权利要求1-9中任一项的组合物，其中，所述组合物不包含可检测的岩藻糖。12.权利要求1-9中任一项的组合物，其中，通过岩藻糖测试测量，所述组合物不包含可检测的岩藻糖。13.权利要求1-12任一项的组合物，其中，所述组合物不包含当与多糖选择性标记试剂组合时可视觉检测的多糖。14.权利要求13的组合物，其中，所述多糖选择性标记试剂为(4，6_二氯三嗪基)-氨基荧光素(DTAF)。15.一种革兰氏阴性细菌质粒组合物，其包含革兰氏阴性细菌质粒DNA、少于约0. Img 每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸以及少于约0. Img每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。16.权利要求15的组合物，其中，所述组合物进一步包含少于约0.Img每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。17.权利要求16的组合物，其中，所述组合物不包含可检测的荚膜异多糖酸、糖醛酸及岩藻糖。18.一种革兰氏阴性细菌质粒组合物，其包含革兰氏阴性细菌质粒DNA、少于约0. 05mg 每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的荚膜异多糖酸以及少于约0. 05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的岩藻糖。19.权利要求15的组合物，其中，所述组合物进一步包含少于约0.05mg每毫克革兰氏阴性细菌质粒DNA的糖醛酸。20.权利要求19的组合物，其中，所述组合物进一步不包含可检测的荚膜异多糖酸、岩藻糖、糖醛酸、染色体DNA或基因组DNA、RNA、蛋白质和/或内毒素污染物。21.一种用于纯化质粒DNA的方法，所述方法包括使用多肽处理含有质粒DNA的含水组合物以消化荚膜异多糖酸，然后将质粒DNA从经处理的含水组合物中分离。22.权利要求21的方法，其中，所述含水组合物选自粗细菌裂解液、部分纯化的细菌裂解液以及含有提取的细菌核酸的含水溶液。23.权利要求21的方法，其中，所述含水组合物为粗细菌裂解液。24.权利要求21的方法，其中，所述含水组合物为部分纯化的细菌裂解液。25.权利要求21的方法，其中，所述含水组合物为含有提取的细菌核酸的含水溶液。26.权利要求21-25中任一项的方法，其中，所述分离包括将所述经处理的含水组合物与层析材料组合。27.权利要求沈的方法，其中，所述层析材料选自阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、疏水相互作用层析树脂及亲和层析树脂。28.权利要求沈的方法，其中，所述分离包括将所述经处理的含水组合物与亲和层析树脂组合，随后将经处理的含水组合物与疏水相互作用层析树脂组合。29.权利要求21-29中任一项的方法，其中，在使用多肽处理之前预处理所述含水组合物以从含水组合物中部分去除内毒素，所述预处理包括将所述含水组合物与层析材料组30.权利要求观的方法，其中，所述亲和层析树脂包括基于硼酸的或者含有硼酸盐的化合物。31.权利要求四的方法，其中，所述层析材料为阴离子交换树脂。32.权利要求31的方法，其中，所述阴离子交换树脂包括季铵树脂。33.权利要求21-33中任一项的方法，其进一步包括过滤所述含水组合物以进一步从质粒DNA中分离内毒素。34.权利要求33的方法，其中，所述过滤在从层析材料洗脱经处理的含水组合物之后进行。35.权利要求21-34中任一项的方法，其中，所述多肽为重组多肽。36.权利要求21的方法，其中，在使用多肽处理之前预处理所述含水组合物以从含水组合物中部分去除内毒素，所述预处理包括将所述含水组合物与层析材料组合；在使用多肽处理后与亲和层析树脂组合，随后与疏水相互作用层析树脂组合；以及在将质粒DNA从所述疏水相互作用层析树脂上洗脱后，过滤以进一步从质粒DNA中分离内毒素。37.权利要求21-36中任一项所述的方法，其中，所述多肽包含与SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。38.权利要求21-36中任一项所述的方法，其中，所述多肽包含与SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列。39.权利要求21-36中任一项的方法，其中，所述多肽为SEQID NO :1。40.权利要求21-36中任一项的方法，其中，所述多肽为SEQID NO :2。41.权利要求1的方法，其中，所述质粒DNA为革兰氏阴性细菌质粒DNA。42.一种用于纯化质粒DNA的方法，所述方法包括(a)通过将含水组合物与阴离子交换树脂组合预处理含有质粒DNA的含水组合物；(b)使用多肽处理所述经预处理的含水组合物以消化荚膜异多糖酸；(c)将所述质粒DNA从经处理的含水组合物中分离，该分离包括将经处理的含水组合物与亲和层析树脂组合，随后将经处理的含水组合物与疏水相互作用层析树脂组合；以及(d)过滤所述质粒DNA。43.权利要求42的方法，其中，所述阴离子交换树脂包括季铵树脂。44.权利要求42或43的方法，其中，所述亲和层析树脂包括基于硼酸的或者含有硼酸盐的化合物。45.权利要求42-44中任一项所述的方法，其中，所述多肽包含与SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。46.权利要求42-44中任一项所述的方法，其中，所述多肽包含与SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列。47.权利要求42-44中任一项的方法，其中，所述多肽为SEQID NO :1。48.权利要求42-44中任一项的方法，其中，所述多肽为SEQID NO :2。49.权利要求42-48中任一项的方法，其中，所述质粒DNA为革兰氏阴性细菌质粒DNA。50.权利要求42-48中任一项的方法，其中，所述多肽为重组多肽。51.一种多肽，其包含与SEQ ID NO :1及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。52.权利要求51的多肽，其中，所述氨基酸序列与SEQID NO 1及其...
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