【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】病毒性呼吸道感染的治疗方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求于2020年5月26日提交的美国临时专利申请第63/030,214号的优先权，其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。
[0003]专利技术背景
[0004]冠状病毒是可引起普通感冒、重症急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)等疾病的一个病毒家族。SARS于2003年首次在亚洲报道。在2003年SARS全球爆发得到遏制之前，该疾病已传播到北美、南美、欧洲和亚洲的二十多个国家。SARS的症状类似于感冒和流感样症状，例如感染SARS的个体通常表现出高热、全身酸痛、头痛、干咳、寒战、疲劳或不适、腹泻、呼吸困难(气短)和低氧血症(低血氧浓度)等症状。为了治疗感染SARS的个体，已建议采用治疗上呼吸道和/或下呼吸道区域的疗法。合适的治疗方法包括针对SARS的疫苗接种，以及施用抗生素或抗病毒药物，例如利巴韦林、四环素、红霉素和皮质类固醇(例如甲基强的松龙)。
[0005]中东呼吸综合征(MERS)是一种病毒性呼吸系统疾病，也是由冠状病毒引起的。它于2012年在沙特阿拉伯首次报道，并传播到其它几个国家，包括美国。大多数感染MERS
‑
CoV的人会出现严重的呼吸系统疾病，包括发热、咳嗽和呼吸急促。其中许多人死亡。MERS
‑
CoV通过密切接触从病人传播给他人，例如照顾感染者或与感染者一起生活而接触。
[0006]在2019年，一种新的冠状病毒被称为重症急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS>‑
CoV
‑
2)。该病毒引起的疾病称为2019冠状病毒病(COVID
‑
19)。COVID
‑
19已引起世界大流行，导致数百万感染者患上严重疾病和死亡。
[0007]鉴于冠状病毒引起重症呼吸性病症的能力，重要的是找到治疗由这些病毒引起的呼吸性病症的方法。本公开满足了这种需要并且还提供了其它优点。
[0008]专利技术简述
[0009]在某些实施方式中，本文公开了在有需要的个体中治疗由病毒引起的呼吸性病症的方法，所述方法包括向所述个体施用一种表达载体，所述该表达载体包含：a.第一插入物，其包含编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM
‑
CSF)序列的核酸序列；及b.第二插入物，其包含编码至少一种双功能短发夹RNA(bi
‑
shRNA)的核酸序列，所述bi
‑
shRNA能够与编码弗林蛋白酶的mRNA转录物的区域杂交，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达，其中bi
‑
shRNA掺入切割依赖性siRNA和切割非依赖性miRNA基序，其中所述病毒使用通过个体产生的弗林蛋白酶以使个体的细胞能够被病毒感染，并且其中施用所述表达载体治疗所述呼吸性病症。在一些实施方式中，施用所述表达载体减少或消除了引起呼吸性病症的病毒的繁殖。在一些实施方式中，第二插入物包含根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些实施方式中，所述个体是人。在一些实施方式中，所述表达载体是质粒。
[0010]在一些实施方式中，所述表达载体在施用前用至少一种稳定化赋形剂冻干，从而产生冻干颗粒。在一些实施方式中，至少一种稳定化赋形剂是海藻糖。在一些实施方式中，所述冻干颗粒的直径小于5μm。在一些实施方式中，所述冻干颗粒的直径为约1μm至3μm。在一些实施方式中，向所述个体施用约1mg至约4mg的表达载体。在一些实施方式中，所述施用
NO:3的核酸序列。在一些实施方式中，所述至少一种稳定化赋形剂是海藻糖。
[0017]在一些实施方式中，所述液体组合物包含约3％至7％w/v的至少一种稳定化赋形剂。在一些实施方式中，所述液体组合物包含约5％w/v的至少一种稳定化赋形剂。在一些实施方式中，所述表达载体是质粒。在一些实施方式中，所述冻干颗粒的直径小于5μm。在一些实施方式中，所述冻干颗粒的直径为约1μm至3μm。
[0018]在一些实施方式中，GM
‑
CSF是人GM
‑
CSF序列。在一些实施方式中，所述表达载体进一步包含启动子。在一些实施方式中，所述启动子是巨细胞病毒(CMV)哺乳动物启动子。在一些实施方式中，所述表达载体进一步包含CMV增强子序列和CMV内含子序列。在一些实施方式中，第一插入物和第二插入物可操作地连接于启动子。在一些实施方式中，所述表达载体进一步包含在第一和第二核酸插入物之间的编码小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽的核酸序列。
[0019]通过引用并入
[0020]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其并入程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请均具体且单独地指明通过引用并入。
[0021]附图简述
[0022]本公开的新特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考阐述以下阐述示例的实施方式的详细描述可以获得对本公开的特征和优点的更好理解，其中利用了本公开的原理和附图：
[0023]图1A示出包含具有miR
‑
30a主链的两个茎环结构的bi
‑
shRNA
弗林蛋白酶
(SEQ ID NO:2)的示意图；第一个茎环结构具有完全互补的引导链(guiding strand)和随从链(passenger strand)，而第二个茎环结构在随从链的第9至11位具有三个碱基对(bp)错配。
[0024]图1B示出包含具有SEQ ID NO:3的miR
‑
30a主链的两个茎环结构的bi
‑
shRNA
弗林蛋白酶
的示意图；其中第一茎环结构具有完全互补的引导链和随从链，而第二茎环结构在随从链的第9至11位具有三个碱基对(bp)错配。
[0025]图2描绘了示出含有用于表达的GM
‑
CSF基因和双功能弗林蛋白酶sh
‑
RNA以及卡那霉素盒和CMV启动子的5140碱基对(bp)(SEQ ID NO:4)的质粒的示意图。
[0026]图3示出冻干程序，其中表达载体在溶液中，并且可以被快速冷冻和冻干。冻干后，冻干的粉末成为干粉。干粉可在干粉吸入器中雾化。
[0027]图4A
‑
4C示出使用当代72B/CA/CALG菌株敲低弗林蛋白酶可减少SARS
‑
COV
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2病毒RNA。
[0028]图5A
‑
5D示出冻干质粒的抗病毒作用。
[0029]专利技术详述
[0030]除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
[0031]定义
[0032]如本文所用，范围和量可以“大约”特定值或范围表述。大约还包括确切量。因此，“大约5μg”表示“大约5μg”，也表示“5μg”。通常，术语“大本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在有需要的个体中治疗由病毒引起的呼吸性病症的方法，所述方法包括向所述个体施用表达载体，所述表达载体包含：a.第一插入物，其包含编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM
‑
CSF)序列的核酸序列；和b.第二插入物，其包含编码至少一种双功能短发夹RNA(bi
‑
shRNA)的核酸序列，所述bi
‑
shRNA能够与编码弗林蛋白酶的mRNA转录物的区域杂交，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达，其中所述bi
‑
shRNA掺入切割依赖性siRNA和切割非依赖性miRNA基序，其中所述病毒使用由所述个体产生的弗林蛋白酶以使所述个体的细胞能够被病毒感染，并且其中所述表达载体的施用治疗所述呼吸性病症。2.权利要求1的方法，其中施用所述表达载体降低或消除引起所述呼吸性病症的病毒的繁殖。3.权利要求1或2的方法，其中所述第二插入物包含根据SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的核酸序列。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述第二插入物包含根据SEQ ID NO:3的核酸序列。5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述个体是人。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述表达载体是质粒。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述表达载体在施用之前与至少一种稳定化赋形剂一起冻干，从而产生冻干颗粒。8.权利要求7的方法，其中所述至少一种稳定化赋形剂是海藻糖。9.权利要求7或8的方法，其中所述冻干颗粒的直径小于5μm。10.权利要求9的方法，其中所述冻干颗粒的直径为约1μm至3μm。11.权利要求1至10中任一项的方法，其中向所述个体施用约1mg至约4mg的所述表达载体。12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述施用包括肺部递送。13.权利要求12的方法，其中所述施用包括通过选自吸入器或雾化器的装置将所述表达载体肺部递送至所述个体。14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述病毒包含需要通过弗林蛋白酶切割以允许所述病毒进入所述个体的细胞中的糖蛋白。15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述细胞是肺泡细胞。16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述引起呼吸性病症的病毒是冠状病毒。17.权利要求16的方法，其中所述冠状病毒是选自重症急性呼吸综合征冠状病毒
‑
2(SARS
‑
CoV
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2)、SARS
‑
CoV和MERS
‑
CoV的成员。18.权利要求1至17中任一项的方法，其中所述呼吸性病症是冠状病毒疾病2019(COVID
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19)。19.权利要求1至18中任一项的方法，其中所述GM
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CSF是人GM
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CSF序列。20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述表达载体进一步包含启动子。21.权利要求20的方法，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)哺乳动物启动子。
22.权利要求21的方法，其中所述表达载体进一步包含CMV增强子序列和CMV内含子序列。23.权利要求20至22中任一项的方法，其中所述第一插入物和所述第二插入物与所述启动子可操作地连接。24.权利要求1至23中任一项的方法，其中所述表达载体进一步包含在所述第一和第二核酸插入物之间的编码小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽的核酸序列。25.一种可吸入剂型，其包含：a.一种表达载体，其包含i.第一插入物，其包含编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)序列的核酸序列；和ii.第二插入物，其包含编码至少一种双功能短发夹RNA(bi
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shRNA)的核酸序列，所述bi
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shRNA能够与编码弗林蛋白酶的mRNA转录物的区域杂交，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达，其中所述bi
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shRNA掺入切割依赖性siRNA和切割非依赖性miRNA基序；和b.至少一种稳定化赋形剂。26.权利要求25的可吸入剂型，其中所述第二插入物...
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