一种激活重构胚的方法技术

本发明专利技术公开了一种激活重构胚的方法。本发明专利技术提供的上述方法包括将所述重构胚用钙离子激活剂进行2次以上的处理，然后将处理过的重构胚在蛋白合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂或磷酸二酯酶抑制剂中激活，得到激活了的重构胚。实验证明：重构胚经ionomycin激活处理2次后，克隆胚胎质量提高，将克隆胚胎移植如受体母牛(母羊)后，妊娠率、发育到期率、犊牛(羔羊)存活率大幅提高，新生犊牛(羔羊)的畸形率显著降低；如表6中体内发育情况表明，2次ionomycin激活处理组的40天的妊娠率(23.4％)、羔羊出生率(15.9％)显著高于1次处理组。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种激活重构胚的方法。
技术介绍
在体细胞克隆时，得到融合的重构胚后要进行激活处理。其常规处理方法是：用钙离子激活剂如离子霉素(ionomycin)、钙离子载体A23187、staurosporine、SrCl2、电脉冲刺激等处理，再经过蛋白合成抑制剂处理。如在牛、羊体细胞克隆时，先用5μM的ionomycin处理5min，只处理1次。之后，把胚胎经10μg/ml cycloheximide中处理5hr，即完成激活处理。但是这种方法得到的克隆胚胎的质量不高。经过这种方法激活得到的胚胎的发育质量较差。在羊中，克隆胚胎的碎裂情况严重。胚胎移植后，妊娠率不高，克隆效率较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种激活重构胚的方法。本专利技术提供的上述方法包括将离体的待激活重构胚用钙离子激活剂进行2次以上的处理，然后将处理过的重构胚在蛋白合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂或磷酸二酯酶抑制剂中激活，得到激活了的重构胚。在一实施例中，上述处理的次数为2次；所述处理包括如下步骤：1)将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培养液中培养10-15分钟；2)在步骤1)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟。在另一实施例中，上述处理的次数为3次；所述处理包括如下步骤：1)将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培养液中培养10-15分钟；2)在步骤1)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培养液中培养10分钟；3)在步骤2)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中2分钟。上述胚胎培养液是在CR1aa培养液或SOFaa培养液中添加BSA得到的培养液；所述BSA在所述胚胎培养液的终浓度是0.4g/100ml；所述培养条件是38.5℃和5％CO2。其中CR1aa培养液和SOFaa培养液的溶剂均为水，溶质分别如表1和表2所示。表1.CR1aa培养液的溶质  溶质  浓度(/L)  NaCl  6.7g  KCl  0.23g  NaHCO3  2.2g  庆大霉素(Sigma，G1397)  50μL  乳酸半钙(hemicalcium lactate)  0.55g  丙酮酸钠(pyruvate)  0.04g  L-谷氨酰胺(L-glutamine)  0.146g  非必需氨基酸(V/V)(Sigma，M7145)  1000μL  必需氨基酸(Sigma，B6766)  2000μL表2.SOFaa培养液的溶质  溶质  浓度(/L)  NaCl  6.33g  KCl  0.533g  CaCl2  0.19g  KH2PO4  0.162g  MgSO4.7H2O  0.18g  NaHCO3  2.1g  Na pyruvate  0.036g  Na lactate  0.37g  谷氨酰胺  0.146g  Myo-inositol  0.05g  非必需氨基酸(V/V)(Sigma，NM7145)  1000μL  必需氨基酸(Sigma，B6766)  2000μL上述钙离子激活剂为离子霉素、钙离子载体A23187、乙醇或氯化锶。上述离子霉素存在于培养液一中，所述培养液一与上述的胚胎培养液相同；所述离子霉素在所述培养液一中的终浓度是2.0-5.0μmol/L。进一步，上述蛋白合成抑制剂是cycloheximide(放线菌酮)；上述蛋白质磷酸化抑制剂是6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤)；所述放线菌酮和所述6-二甲氨基嘌呤分别存在于培养液二和培养液三中，所述培养液二、培养液三与上述的胚胎培养液均相同；所述放线菌酮在所述培养液二中的终浓度是优选为10μg/mL；所述6-二甲氨基嘌呤在所述培养液三中的终浓度是优选为1.9-2.1mmol/L；所述激活的时间为4-6小时。任一上述的激活重构胚的方法在培育克隆动物胚胎或转基因动物克隆胚胎中的应用属于本专利技术的保护范围之内。任一上述的激活重构胚的方法在培育克隆动物或转基因克隆动物中的应用也属于本专利技术的保护范围之内。上述动物可以是牛、羊、猪或鼠。实验证明：重构胚经ionomycin激活处理2次后，克隆胚胎质量提高，将克隆胚胎移植如受体母牛(母羊)后，妊娠率、发育到期率、犊牛(羔羊)存活率大幅提高，新生犊牛(羔羊)的畸形率显著降低。显著提高了体细胞克隆与转基因克隆动物生产效率(表3-表6)；如表6中体内发育情况表明，2次ionomycin激活处理组的40天的妊娠率(23.4％)、羔羊出生率(15.9％)显著高于1次处理组。具体实施方式下列实施例中所用的原料若无特别说明均能够从商业途径获得。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、日本和牛的体细胞克隆一、体细胞培养与处理1、日本和牛的成年成纤维细胞的分离、培养取离体的来自内蒙古旭日公司成年的日本和牛的耳尖组织。耳皮肤局部先用手术刀片刮毛，再用70％-75％的酒精消毒，用组织剪迅速剪取耳尖约1cm3大小的组织，立即在70％-75％的酒精中浸泡60s，在含250U/mL青霉素和250μg/mL链霉素的灭菌PBS中清洗2-3遍，放入相同溶液中，4℃带回实验室。在超净工作台内，耳组织于60mm培养皿中用PBS漂洗2遍后，放入青霉素瓶内，不加任何溶液，用眼科剪反复剪切组织块至约1mm3大小。用PBS和含20％FBS的DMEM(DMEM+20％FBS)各清洗3遍后，挑取组织块，接种于2-3个60mm培养皿中，每皿约接种20-30个组织块，放入CO2培养箱，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下，进行干涸培养3hr，然后加入5mL含DMEM+20％FBS进行原代培养。当细胞生长达到90％汇合时，吸出培养液，用灭菌PBS清洗3遍，加入1mL 0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液，37℃消化2-3min，立即加入2mL DMEM+10％FBS终止消化。然后按照1∶4传代。2、胎儿成纤维细胞的分离与培养采取活体手术本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种激活重构胚的方法，包括将离体的待激活重构胚用钙离子激活剂进行２次以上的处理，然后将处理过的重构胚在蛋白合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂或磷酸二酯酶抑制剂中激活，得到激活了的重构胚。

【技术特征摘要】
1.一种激活重构胚的方法，包括将离体的待激活重构胚用钙离子激活剂进行2
次以上的处理，然后将处理过的重构胚在蛋白合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂或磷
酸二酯酶抑制剂中激活，得到激活了的重构胚。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述处理的次数为2次；所述处理包
括如下步骤：
1)将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培
养液中培养10-15分钟；
2)在步骤1)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述处理的次数为3次；所述处理包
括如下步骤：
1)将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将所述重构胚转入胚胎培
养液中培养10-15分钟；
2)在步骤1)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中5分钟；再将
所述重构胚转入胚胎培养液中培养10分钟；
3)在步骤2)的基础上，将所述重构胚放置在所述钙离子激活剂中2分钟。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述胚胎培养液是在CR1aa培养
液或SOFaa培养液中添加BSA得到的培养液；所述BSA在所述胚胎培养液的终浓度是
0.4g/100ml；所述培养条件是38.5℃和5％CO2；所述CR1aa培养液和SOFaa...

【专利技术属性】
技术研发人员：李光鹏，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：15