提高产1，3-丙二醇融合菌筛选效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高产1，3-丙二醇融合菌筛选效率的方法，主要过程包括：选择亲本菌株；亲本菌株进行酶解脱壁得到原生质体；原生质体进行灭活处理；灭活的原生质体进行原生质体融合；筛选融合子，选择性能优良的目的融合菌；优良融合菌株作为亲本进入下一轮基因组重排过程，至获得综合性能优良的菌株；其中亲本菌株酶解脱壁得到的原生质体或灭活原生质体进行膜过滤处理后进行后续处理操作。与现有基因工程融合菌筛选方法相比，本发明专利技术方法可以有效提高目标菌株的筛选效率，同时具有操作方便，不需昂贵的实验仪器，适合于工业菌株育种等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种应用基因组重排技术制备产1，3-丙二醇基因工程融合菌的筛选方法，特别是提高基因工程融合菌筛选效率的方法，属于工业生物

技术介绍
1，3_丙二醇(PDO)是一种重要的化工和医药中间体原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、乳化剂、抗冻剂等。PDO最主要的用途，是合成新型聚酯高分子材料聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的单体。PTT是目前国际上公认的六大石化新产品之一。与聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龙等比较，PTT具有良好的印染特性、富有弹性、抗紫外线、静电性能好、可生物降解并再生利用等多种优良特性，因此PTT在纺织服装业、地毯装饰业、工程塑料等众多领域有着十分广阔的应用前景。据估计，目前仅我国每年就需求PDO上百万吨，而且在未来十年我国对PDO的需求量还将继续增大。PTT生产的关键在于单体原料PDO的来源，其生产成本直接影响着PTT的工业化生产和应用规模。1，3_丙二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法目前仅有国外DuPont和Siell公司以及国内的少数几家单位在进行小规模工业化生产。技术路线分别是德国Degussa公司的丙烯醛合成法专利技术和Siell公司开发的环氧乙烷合成法， 并用于聚合生产PTT。为了垄断市场，这两家跨国公司不对外销售用于PTT生产的PD0，而只向客户销售PTT切片及其下游产品。同时，化学合成法存在设备投资大、工艺要求严格、 操作条件苛刻、有毒副产物多、产品提取难度大、三废处理成本高以及生产原料依赖于不可再生的石油资源等问题，导致PTT材料及其原料产品PDO的价格一直居高不下，制约其进一步的发展。而微生物发酵法生产PD0，以可再生资源——碳水化合物为原料，具有操作简便、 反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理以及成本低廉等优点，引起了国内外相关企业和研究单位的高度重视，将具有广泛的应用前景和开发潜力。微生物发酵法的生产方法包括一是利用从自然界获得的菌株以甘油为底物直接发酵生产1，3_丙二醇；二是构建基因工程菌以葡萄糖或甘油为底物发酵生产1，3_丙二醇； 基因工程菌构建策略主要有5种(1)强化原始菌株中还原途径限速酶的表达及阻止副产物的代谢途径；(2)将1，3-丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因克隆到甘油生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3_丙二醇的基因工程菌；(3)将甘油生产菌的DAR1、GPP2基因克隆到1，3_丙二醇生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌；(4)将产1，3_丙二醇的dha调控子基因克隆到大肠杆菌中，获得能转化甘油为1， 3-丙二醇的基因工程菌；(5)将1，3_丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因和甘油生产菌的DARl、 GPP2基因克隆到大肠杆菌中，从而获得能将葡萄糖转化为1，3_丙二醇的基因工程菌。目前，国外DuPont公司已经在大肠杆菌中成功构建了以葡萄糖为底物发酵1. 3-丙二醇的途径，产量高达135g/L。国内众多研究机构也纷纷针对产1，3-丙二醇途径中的关键酶进行了深入的研究，在模式大肠杆菌成功表达关键酶基因，但产量水平较低，而针对原始生产菌株肺炎克雷伯氏菌的基因工程手段改造鲜见报道，随着国际范围内生物柴油工业的广泛兴起，将产生大量的剩余副产品甘油，为利用发酵法制备1，3_丙二醇提供了丰富的原料。基因组重排技术作为新型的育种技术，基于原生质体融合技术之上，使不同基因组发生重排的过程。其主要机制在于利用原生质体融合达到全基因组片段交换、重组，经过多轮递归融合后促使正向突变表型聚集，相较诱变育种、原生质体融合人技术等，基因组重排技术具有更高的效率。其次，基因组重排技术可以无需了解相关微生物的代谢途径、关键酶的表达基因、 转录调控等知识背景，尤其适合微生物代谢途径的遗传改造。尽管DNA重组技术可以在多亲本之间发生基因重排，但改变的是基因片段而不是整个基因组。微生物细胞的表型受代谢要求，能源利用，环境压力、全基因组水平表达而决定的，所以通过几个特殊基因的定向改造是很难达到菌株表型的优化。而基因组重排技术是全基因组工程策略，在无需知道基因组信息及代谢网络信息情况下，就可以运用于菌株改良。此外，基因组重排技术操作简单，容易推广，不需要昂贵的实验仪器，而且见效快。因此，基因组重排育种很适合工业菌株的改造工程，不仅体现成本经济效应，还具备高效性。基因组重排技术充分结合了细胞工程和代谢工程的优势，不仅可以进行菌种表型快速高效优化，还可为不同种类的微生物复杂的代谢和调控网络提供了信息来源。目前，基因组重排技术主要应用于提高微生物代谢产物产率，增强菌株对环境的耐受性以及底物的利用率。2008 年，Yu 等(Yu L，Pei XL, Lei Τ, Wang Y, Feng Y. Genome shuffling enhanced L-Iactic acid production by improving glucose tolerance of Lactobacillus rhamnosus. J Biotechnol. 2008，134 (1-2) :154-9)通过基因组重排技术，对鼠李糖乳酸杆菌经过两轮育种后乳酸产量比野生菌提高了 71.4%。在2009年，Jin等(Jin ZH, Xu B, Lin SZ, Jin Q, Cen P. Enhanced production of spinosad in Saccharopolyspora spinosa by genome shuffling. Appl BiochemBiotechnol 2009. doi :10. 1007/sl2010-008-8500-0) 研究Saccharopo 1 yspora sp inosa的基因组重排育种工作，经过四轮重排后，筛选到了两株高产多杀菌素的融合菌，生产能力比原始出发菌株提高了 201%和436%。BurWiard Otte 等(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec.2009，p. 7610-7616 Vol.75， No. 240099-2240/09/doi :10. 1128/AEM. 01774-09)首次结合传统诱变育种和基因组重排技术，以Clostridium diolis为亲本菌株，筛选到了高耐甘油和1，3-丙二醇的工程菌，1， 3-丙二醇的浓度提高到85g/L。采用基因组重排过程获得优良目的菌株的工作量较大，主要过程包括原生质体的获取、原生质体的灭活诱变、原生质体的融合、融合子的筛选等步骤。基因组重排一般需要多轮操作，每步骤的条件稍有变化对最终结果都可能产生明显的影响，基因组重排过程需要大量人力、物力和时间。科学高效的融合子筛选方法是基因组重排育种技术过程成功的关键。融合子筛选一直面临着正常菌体的干扰，目前还缺乏有效的解决方法，因此提高基因组重排过程筛选适宜菌株的效率是本领域迫切需要解决的问题。本专利技术在制备原生质体过程中通过膜过滤除去正常菌体，有效避免了正常菌体对筛选的干扰，极大减轻原生质体对酶解条件的苛刻要求，还能促进融合概率。
技术实现思路
本专利技术提供一种提高产本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种提高产１，３－丙二醇融合菌筛选效率的方法，包括如下过程：（１）选择亲本菌株，或菌种经适宜培养得到亲本菌株；（２）亲本菌株进行酶解脱壁得到原生质体；（３）原生质体进行灭活处理得到灭活原生质体；（４）灭活的原生质体进行原生质体融合；（５）用含有目的发酵产物的培养基筛选融合子，选择性能优良的目的融合菌；（６）步骤（５）获得的优良融合菌株作为亲本进入下一轮基因组重排过程，至获得综合性能优良的菌株；其特征在于：步骤（２）的亲本菌株酶解脱壁得到的原生质体或步骤（３）的灭活原生质体进行膜过滤处理，膜过滤处理采用０．１５～０．８５μｍ滤膜过滤除去对原生质体融合有影响的菌体，然后进行后续处理操作。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金平，王领民，师文静，李晓姝，王崇辉，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，
类型：发明
国别省市：11