本发明专利技术公开了连续吸附耦合发酵生产ThailandepsinA的方法，步骤为：产生抗癌物质ThailandepsinA的伯克氏菌经种子活化培养，接入发酵罐发酵；在发酵罐中ThailandepsinA和菌体浓度达到一定程度，即发酵30～48小时，处于对数生长的中后期时，将发酵液连续通过吸附柱，利用其内部的大孔吸附树脂吸附ThailandepsinA，经吸附后的发酵液返回发酵罐继续发酵；以流加方式往所述发酵罐中补充葡萄糖，维持ThailandepsinA的不断合成；最后终止发酵；取出大孔吸附树脂，萃取分离、提纯ThailandepsinA。本发明专利技术实现ThailandepsinA的连续、高密度发酵，提高发酵产量，延长发酵周期，同时由于可从大孔吸附树脂中有效回收产物ThailandepsinA，简化后处理工艺，大大降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵领域，特别涉及伯克氏菌发酵与大孔吸附树脂连续吸附耦合发酵生产Thailand印sin A的方法。
技术介绍
伯克氏菌似64(.Burkholderia thailandensis E264, ATCC 700388)能够合成组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC inhibitor)类抗癌物质Hiailand印sin A。作为与已被美国 FDA批准上市的抗癌药物Π(228 (格洛斯特医药公司，商品名Istodax)有不同的选择性抑制特点的结构类似物，Thailand印sin A具有特殊的缩酯环肽结构，可有效透过细胞膜，通过抑制组蛋白去乙酰酶而显示良好的抗肿瘤活性。美国国家癌症研究所NCI60数据显示， Thailandespin A有着广泛的抑制癌细胞增殖活性，特别对结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌和肾癌有明显作用，对皮肤T细胞淋巴瘤的疗效尤为显著。它被录入美国国家癌症研究所(NCI) 的发展治疗学项目(Developmental Therapeutics Program)，用于筛选NCI60人类癌症细胞系，编号为NSC D751510。目前，Thailand印sin A已进入临床试验阶段。作为一种极具开发前景的抗癌药物，Thailand印sin A有望在不远的将来作为商品药物推广，但是目前Thailand印sin A的发酵产量很低，而且人工合成非常困难，因此如何实现jThai land印sin A的高产有重要需求，也是目前Thai land印sin A应用的障碍之一。 目前，关于如何提高Thailand印sin A的发酵产量鲜有报道。专利技术内容本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种连续吸附耦合发酵生产 Thailand印sin A的方法。该方法通过连续吸附耦合装置，原位吸附分离Thailand印sin A 产物，从而解除Thailand印sin A的产物负反馈抑制，提高产物发酵产量，简化生产工艺流程。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的本专利技术涉及的一种连续吸附耦合发酵生产Thailand印sin A的方法，包括以下步骤(a)将产生Thailand印sinA的伯克氏菌经种子活化培养，接入发酵罐中，发酵；(b)当发酵罐中Thailand印sinA和菌体浓度达到一定程度，即发酵30-48小时， 处于对数生长的中后期，将发酵液连续输入吸附柱，利用吸附柱中的大孔吸附树脂吸附 Thailand印sin A，经吸附后的发酵液返回发酵罐继续发酵；(c)以流加方式向发酵罐中补充葡萄糖，维持Thailand印sinA的不断合成；(d)在Thailand印sinA合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵12-36小时后， 终止发酵，取出大孔吸附树脂，萃取分离，提纯，得到Thailand印sin A。优选的，步骤(a)中，所述发酵罐中，加入放大培养基的体积占发酵罐罐体装液量体积的分数为50 80%。优选的，步骤(a)中，所述放大培养基每升含以下质量的各组分葡萄糖10 20g、胰蛋白胨20 40g、氯化钠0 5g、K2HP04. 3H20 15 30g、KH2P04 2 6g和柠檬酸钠2 20mgo优选的，步骤(a)中，所述发酵的发酵温度为28 37°C。优选的，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂使用前经过预处理，所述预处理为将所述大孔吸附树脂浸没在体积分数为30 60%的乙醇溶液中12 Mh。优选的，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂的体积占所述吸附柱内容物总体积的分数为4 20%O优选的，步骤(b)中，所述大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，平均孔径AVE为150 300。优选的，步骤(b)中，所述吸附柱的使用方式为多个并联使用、单独使用或者交替使用。优选的，步骤(b)中，所述吸附柱的材质为可高温灭菌处理的材料。优选的，所述可高温灭菌处理的材料为金属、陶瓷或玻璃。与现有技术相比，本专利技术将大孔树脂吸附和伯克氏菌发酵生产Thailand印sin A 相结合，产物的发酵合成和吸附分离同时进行，具有以下有益效果(1)通过Thailand印sin A产物的吸附原位分离，可以有效解除产物对发酵过程的负反馈抑制，大幅提高iThailand印sin A的发酵产量。(2)将发酵产物Thailand印sin A吸附到大孔吸附树脂上，节省了后续分离工艺的时间和资源，产物的后处理更为简单、方便。(3)连续发酵过程中容易实现培养基及营养成分的流加，有助于产量的提高。(4)连续吸附耦合发酵装置制作较为简单、成本低，循环顺畅，操作方便，易于实现自动化，可以有效降低生产成本、提高生产效率；本工艺适合大规模生产应用。(5)连续吸附耦合发酵过程将吸附过程和发酵过程分离，从而便于进一步对吸附过程和发酵过程分别进行精细化控制，从而具有进一步提高生产效率的潜力。附图说明图1为连续吸附耦合发酵生产抗癌物质Thailand印sin A的工艺流程其中1、发酵罐，2、吸附柱，3、空气压缩机，4、流加补料瓶，5、酸碱平衡补料瓶，6、恒流泵，7、三通阀。具体实施例方式下面结合说明书附图和具体实施例做进一步的阐述实施例1，不同循环流速条件下Hiailandepsin A的连续吸附耦合发酵 (一)仪器设备及原材料德国赛多利斯BIOSTAT A plus 5L机械搅拌发酵罐、上海锦欣SunSource OLFlOOAFm 噪音无油空气压缩机、保定兰格BT-100恒流泵、日本三洋电子MLS-3780高压蒸汽灭菌器、 德国诺尔(KNAUER) Smartline 1000高效液相色谱仪(HPLC)。发酵菌株为伯克氏菌似64(.Burkholderia thailandensis E264,ATCC 700388)， 大孔吸附树脂选用三菱化学大孔吸附树脂HP-20。4( 二 )伯克氏菌E264连续吸附耦合发酵如图1所示，连续吸附耦合发酵生产Thailand印sin A的方法，包括以下步骤(1)伯克氏菌E264种子活化培养伯克氏菌E264种子经过一级固体种子保种、二级液体种子活化、三级液体发酵种子活化，活化用于发酵罐放大发酵所用的伯克氏菌E264菌种；(2)连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌往吸附柱2中倒入预处理(所述预处理方法为浸没于30%乙醇溶液中12h)过的大孔吸附树脂(为非极性大孔树脂，平均孔径AVE为 200)，添加量为4%，接口密封连接；往发酵罐1罐体中倒入发酵罐放大培养基(所述发酵罐放大培养基包括葡萄糖10g/L、胰蛋白胨35g/L、氯化钠lg/L，K2HPO4. 3H20 15g/L，KH2PO4 2g/L，柠檬酸钠ang/L)，装液量50% ；将发酵罐1分别和流加补料瓶4和酸碱平衡补料瓶5 连接，将发酵罐1和吸附柱2连接，使整个装置内部形成循环通路；将装置进行高温蒸汽灭菌。(3)发酵罐放大培养将活化后的伯克氏菌E264菌种通过注射法接种于发酵罐 1中，整个过程保证无菌操作；开启通气、搅拌、温控等发酵罐放大培养过程。发酵温度为 28°C。(4)吸附耦合循环开启当发酵罐中Thailand印sin A和菌体浓度达到一定程度， 即发酵30小时，处于对数生长的中后期，开启循环用的恒流泵6，以一定流速将发酵液从发酵罐1输出，通过管路自下而上通过吸附柱2，从而本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种连续吸附耦合发酵生产Ｔｈａｉｌａｎｄｅｐｓｉｎ Ａ的方法，其特征在于，包括以下步骤：（ａ）将产生Ｔｈａｉｌａｎｄｅｐｓｉｎ Ａ的伯克氏菌经种子活化培养，接入发酵罐中，发酵；（ｂ）当发酵罐中Ｔｈａｉｌａｎｄｅｐｓｉｎ Ａ和菌体浓度达到一定程度，即发酵３０～４８小时，处于对数生长的中后期，将发酵液连续输入吸附柱，利用吸附柱中的大孔吸附树脂吸附Ｔｈａｉｌａｎｄｅｐｓｉｎ Ａ，经吸附后的发酵液返回发酵罐继续发酵；（ｃ）以流加方式向发酵罐中补充葡萄糖，维持Ｔｈａｉｌａｎｄｅｐｓｉｎ Ａ的不断合成；（ｄ）在Ｔｈａｉｌａｎｄｅｐｓｉｎ Ａ合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵１２～３６小时后，终止发酵，取出大孔吸附树脂，萃取分离，提纯，得到Ｔｈａｉｌａｎｄｅｐｓｉｎ Ａ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张雪洪，钟鸣，程义强，
申请(专利权)人：上海交通大学，清安医药科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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