可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种可制成静息细胞的连续发酵生产聚苹果酸的方法，实施步骤如下：（1）斜面菌种制备；（2）种子液制备；（3）上述种子液用于接种至5L无菌发酵罐中发酵；（4）发酵前期不控制pH，直至有菌丝球出现后连续流加NaOH控制发酵液pH为5.0-5.5；（5）发酵55-60h后，发酵液中的葡萄糖浓度为8-10g/L时，停止发酵，重新添加新鲜培养基，进行重复发酵；（6）静息细胞制备；（7）采用相同的发酵方法进行静息细胞法发酵；（8）发酵液用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，加入等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重；聚苹果酸的产量为50-57g/L。该方法可有效减少发酵过程中的非最优经济阶段，达到了缩短发酵时间，提高设备利用率，降低产品生产成本的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种发酵生产聚苹果酸的方法，特别涉及一种。
技术介绍
聚苹果酸(polymalic acid, PMLA)是一种具有优良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性的聚合物，最初由Siimada等于1969年研究一种圆弧青霉菌时发现。它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、化学衍生性，聚苹果酸可在水溶液中自发或酶促降解生成小分子L-苹果酸，该L-苹果酸单体可被人体吸收并无任何毒副作用。聚苹果酸分解和燃烧后，最终产物是二氧化碳和水，可被植物吸收，对环境无毒无害。聚苹果酸的诸多特性使其在医学和药学等领域的研究中得到日益广泛的关注。理论研究表明，聚苹果酸及其衍生物可望作为手术缝合线、组织工程支架材料、药物控制释放体系等在生物医药领域获得重要应用。目前已经可以用化学合成或从特定的微生物中得到这种高分子。国内利用微生物发酵生产聚苹果酸一般采用的是一步发酵法或补料发酵法，生产周期为9天，最高产量为 37g/L ；日本采用静息细胞法发酵，历时5天，最高产量是80g/L。由于生产成本非常高，合成的聚苹果酸和天然的聚苹果酸还是比较难得到，因此提供一种高效的、低成本的，是该
科研人员急需开发的新课题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种高效可行并可降低聚苹果酸生产成本，减小投资，降低成本，益于生产应用的。为实现上述目的本专利技术所采用的实施方式如下一种，该方法是出芽短梗霉经一级种子培养后转移到无菌发酵培养基中， 发酵初期不控制PH，当菌丝球出现后控制发酵液PH促进聚苹果酸的合成，然后放出发酵罐中的无菌体发酵液，后加入新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵，重复发酵次数为4-5批次；用无菌的磷酸缓冲液洗涤发酵罐中的菌体制成静息细胞，加入无菌的无氮源发酵培养基进行静息细胞法发酵生产聚苹果酸。具体实施步骤如下(1)斜面菌种制备将出芽短梗霉TJZKBI0153接种到无菌斜面上，在恒温培养48-60h，直至出现黑色孢子；斜面培养基组成包括，单位IL 马铃薯200g，葡萄糖20g， 琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值5.6 ；其中所用菌种出芽短梗酶(Aureobasidium) TJZKBA10326；(2)种子液制备挑取一环上述的出芽短梗霉TJZKBI0153斜面菌种接入种子培养基，在培养48-60h后出现3-5mm菌丝球，用2_6层无菌纱布过滤除去菌丝球获得滤液即种子液，种子液浓度为IO6-IO7个/mL ；种子培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为6%-8% ； 有机氮源为玉米浆、酵母粉、蛋白胨、玉米浆粉中的一种或其两种以上的组合物，无机氮源为丁二酸铵，总氮源浓度为0. 35%-0. 5% ；种子培养基中含有锌、镁、钾无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐，使用量分别为5mg/L-0. 5g/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0. 2-0. 5%，115°C、15min灭菌；500ml规格的摇瓶装液量是100ml，转速为200-230rpm ；(3)发酵培养基灭菌5L发酵罐中加入2.5L发酵培养基，115°C、15min灭菌后， PH5. 0-5.5，冷却至观-301后备用；发酵培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16%; 有机氮源为玉米浆、酵母粉、蛋白胨、玉米浆粉中的一种或其两种以上的组合物，无机氮源为丁二酸铵，总氮源浓度为0. 35%-0. 5% ；发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0. lg/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0. 2-0. 5% ；(4)发酵上述种子液用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，接种量为8%-12%，发酵前期的 12-16h不控制发酵液的pH，直至有直径为3mm-5mm的菌丝球长出，后通过连续流加质量浓度为5%-10%Na0H无菌溶液控制发酵液pH5. 0-5. 5，控制整个发酵过程中的温度为^_30°C， 通气量为3-3. 5L/min,发酵4 后每隔2_4h检测发酵中葡萄糖的含量；(5)放料、加料发酵55-60h后，取样测定发酵液中葡萄糖的浓度为8-10g/L时，从发酵罐中放出发酵液，然后加入3L新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵，发酵4-5批次以后， 菌体产酸能力下降，消耗氢氧化钠的能力明显减弱，停止发酵；(6)静息细胞制备发酵结束放出全部发酵液后用无菌的0.1-0. 2mol/L pH7. 0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，制成静息细胞，磷酸盐缓冲液为钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液；(7)静息细胞发酵将2.5L无氮源发酵培养液添加到5L发酵罐中，控制发酵温度 280C -30°C，通气量为3-3. 5L/min，待pH下降到4. 8-5. 0后通过连续流加NaOH控制发酵液的PH值至5. 0-5. 5 ；发酵4 后每隔2-4h检测发酵中葡萄糖的含量，至发酵液中葡萄糖浓度为8-10g/L，结束发酵；静息细胞发酵培养基的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16% ；静息细胞发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0. Ig/ L,溶剂为0. 1-0. 2mol/L pH7. 0的钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液，此培养基经115°C、15min灭菌；(8)聚苹果酸的提取发酵液使用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，滤液用等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重，得到聚苹果酸的产量为50-57g/L。 本专利技术的有益效果是一次制种可维持5个发酵批次，有效减短了发酵过程中的制种时间，比普通发酵的时间减少了至少180小时，提高了设备的利用率；在第一次发酵后可制成静息细胞，减省了氮源的使用，降低了产品的生产成本；本专利技术采用发酵一段时间后加入碳酸钙的方法，可使菌体在合适浓度范围中最大程度的增殖，从而达到提高发酵产量的目的。本专利技术工艺简单，效果非常显著；使发酵效率提高了 30%，同时降低成本35%，产量比采用普通发酵的产量提高了 46%。具体实施方式以下结合实施例，对依据本专利技术提供的具体实施方式详述如下 实施例1(1)斜面菌种制备按以下配比制备斜面培养基 马铃薯200g/L， 葡萄糖20g/L， 琼脂20g/L，用10%氢氧化钠调pH至5. 6 ； 115°CU5min灭菌制成斜面后，从平板上挑取单菌落划线接种，即将出芽短梗霉TJZKBI0153接种到无菌斜面上，在30°C恒温培养48h，出现黑色孢子。(2)种子液制备按以下配比制备种子培养基 葡萄糖60g/L，丁二酸铵3g/L， 玉米浆0. 5g/L， 丁二酸2g/L， 磷酸二氢钾0. lg/L, 碳酸钠0. 4g/L， 硫酸镁:0. lg/L, 硫酸锌0. 005g/L,用10%氢氧化钠调pH至5. 0，115°C、15min灭菌，降至30°C时，挑取一环上述的出芽短梗霉TJZKBI0153斜面菌种接入种子培养基，500mL规格三角瓶装液量为IOOmL,培养温度 300C，旋转式摇床转速为200rpm，培养48h，出现3mm菌丝球。用灭菌的6层纱布过滤到无菌容器中，得到种子液待用。种子液的菌浓为IO6个/mL。(3)发酵培养基灭菌发酵罐容量为5L，装液量为2. 5L，按照本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于具体实施步骤如下：（１）斜面菌种制备：将出芽短梗霉ＴＪＺＫＢＩＯ１５３接种到无菌斜面上，在２８－３０℃恒温培养４８－６０ｈ，直至出现黑色孢子；（２）种子液制备：挑取一环出芽短梗霉ＴＪＺＫＢＩＯ１５３斜面菌种接入种子培养基，在２８－３０℃培养４８－６０ｈ后，用无菌纱布过滤菌丝体获得滤液即种子液；（３）发酵培养基灭菌：５Ｌ发酵罐中加入２．５Ｌ发酵培养基，１１５℃、１５ｍｉｎ灭菌后冷却至２８－３０℃；（４）发酵：发酵前期不控制发酵液ｐＨ，直至有菌丝球出现后连续流加ＮａＯＨ控制发酵液的ｐＨ值至５．０－５．５，控制整个发酵过程中的温度为２８－３０℃，通气量为３－３．５Ｌ／ｍｉｎ，发酵４８ｈ后每隔２－４ｈ检测发酵中葡萄糖的含量；（５）放料、加料：发酵５５－６０ｈ后，取样测定发酵液中葡萄糖的浓度为８－１０ｇ／Ｌ时，从发酵罐中放出发酵液，然后加入２．５Ｌ新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵；（６）静息细胞制备：发酵结束放出全部发酵液后用无菌的磷酸缓冲液洗涤菌体两次，制成静息细胞；（７）静息细胞发酵：将２．５Ｌ无氮源发酵培养液添加到５Ｌ发酵罐中，控制发酵温度２８℃－３０℃，通气量为３－３．５Ｌ／ｍｉｎ，待ｐＨ下降到４．８－５．０后通过连续流加ＮａＯＨ控制发酵液的ｐＨ值至５．０－５．５　发酵４８ｈ后每隔２－４ｈ检测发酵中葡萄糖的含量，至发酵液中葡萄糖浓度为８－１０ｇ／Ｌ，结束发酵；（８）聚苹果酸的提取：发酵液使用截留分子量为６０００Ｄａ的中空纤维膜过滤，滤液用等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重，得到聚苹果酸的产量为５０－５７ｇ／Ｌ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘云，徐勇虎，李睿颖，国华，胡娅君，王永乐，王晓琼，范婷，
申请(专利权)人：天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：12