本发明专利技术公开了一种山梨糖还原酶在生物法制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。即以氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的山梨糖还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADPH为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。本发明专利技术首次将氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的山梨糖还原酶应用于4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其酶活高达5.6U/mg，其对底物的得率高达90%、产物的对映体过量值为100％，且产量高，大大降低了生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种山梨糖还原酶，特别涉及该山梨糖还原酶在通过生物方法生产(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。
技术介绍
(S)-4-氯-3 羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S) -CHBE) 是一种重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等。以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl C0BE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效的制备途径。迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道。概括起来主要有化学法和生物法。化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂的贵铑、釕等金属，采用化学法合成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高，污染大。生物法分为酶催化和全细胞催化法，Shimi zu等用来自Sporobolomyces salmonicoIorAKU 4429的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系和水/有机溶剂两相体系催化还原COBE制备手性CHBE，由于应用酶催化还原反应所用的酶要从微生物细胞中分离纯化得到，过程操作繁琐且酶容易失活，与全细胞催化相比，应用较少。 全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(S) — CHBE两种，Yasohara等 从400株酵母菌中筛选得到了一株Omdida 卵Wiae，在水/乙酸正丁酯体系中， 在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制pH值的条件下产物(S)-CHBE在有机相的积累浓度可达90 g/L，产物的光学纯度对映体过量值(enantiomeric excess e. e)达到96%。由于采用野生酵母中往往含有多种能够催化COBE为不同构型CHBE 的还原酶，因此采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活性往往很低，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的(S)-CHBE。Yasohara等从木兰假丝酵母菌Candida magnoliae中分离得到了一个辅酶NADPH依赖型的羰基还原酶，将该酶与葡萄糖脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中共表达，在定时添加适量的辅酶NADP和葡萄糖以及分批添加底物的条件下，催化COBE的不对称还原(S) -CHBE,其得率和光学纯度分别为85%和100%e. e. 。综上所述，现有催化COBE为(S) -CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性底、 成本高等问题。本专利中涉及到的还原酶是山梨糖还原酶的一种，其包含281个氨基酸，其 Genbank 巾白勺 & i # 力 XP_715552. 1， (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/XP—715552. 1)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。编码该蛋白的基因含有843bp碱基 ，^^ Genbank 巾白勺力 ΕΑΚ96529. 1， (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/ EAK96529)，其基因序列如SEQ ID NO :1所示。至今未发现该山梨糖还原酶用于COBE不对称还原制备(S)-CHBE的报道。参考文献Karanewsky DSj Badia MCj Ciosek CP Jrj Robl JFj Sofia MJj Simpkins LMj DeLange B， Harrity TWj Biller SAj Gorden EM (1990) Phosphorus-containing inhibitors of HMG-CoA reductase. 1. 4--hydroxyphosphinyl]-3~hy droxybutanoic acids: a new class of cell-selective inhibitors of cholesterol biosynthesis. J Med Chem 33:2925 - 2956。 Shimizu S， Kataoka M，Morishita A Katoh M， Morikawa Tj Miyoshi T，Yamada H (1990a) Microbial asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate to optically active ethyl 4-4-chloro-3-hydroxybutanoate. Biotechnol Iett 12:593一596。 Shimizu S，Kataoka M，Katoh M，Morikawa Tj Miyoshi T，Yamada H(1990b) Stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutaoate by a microbial aldehyde reductase in an organic solvent-water diphasic system. Appl Environ Microbiol 56: 2374-2377。 Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa J，Takahashi S，Wada M，Kataoka Mj Shimizu S (1999) Synthesis of opticalIy activeethyl 4-chloro_3-hydroxybutanoate by microbial reduction. Appl Microbiol Biotechnol 51:847 -851。 Wada M，Kataoka M，Kawabata H，Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa Jj Shimizu S (1998) Purification and characterization of NADPH-ependent carbony1 reductase involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutanoate， from Candida magnoliae. Biosci Biotechnol Biochem 62:280 - 285。 Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa J，Wada M，Kataoka M，Shimizu S (2000) Molecular cloning and overexpression of the gene encoding an NADPH-dependent carbony1 reductase, involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutan本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种山梨糖还原酶在生物法制备（Ｓ）－４－氯－３羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于以氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的山梨糖还原酶为催化剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严明，郝宁，安明东，许晟，蔡萍，许琳，李艳，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84
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