一种生物柴油脂肪复合酶的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种新的生物柴油专用脂肪复合酶的生产方法，其步骤包括：少根根霉D6D脂肪酸脱氢酶基因的截取，PCR扩增，构建表达载体通过酿酒酵母表达，获得高产脂肪酸脱氢酶菌种，废弃油脂经脂肪酸脱氢酶脱氢转化为不饱和脂肪酸再由脂肪酶酯化反应生成脂肪酸甲酯。采用甲基磺酸乙酯(EMS)，紫外光照及LiCl复合诱变处理青霉菌，定向扩大培养诱变菌种，发酵获得扩展青霉脂肪酶。研究将脂肪酸脱氢酶与脂肪酶复配并固定化生产生物柴油，固定化后的复合酶酶活稳定性和使用寿命都大大提高。本发明专利技术操作工艺简单、设备要求低、产率大，适于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种新的脂肪酶复合酶的制备方法，涉及微生物发酵、复配工艺生产脂肪酶复合酶。
技术介绍
脂肪复合酶指的是分解油脂生成脂肪酸、甘油、多不饱和脂肪酸等的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系，主要来自于真菌和细菌。其中2种主要酶组分是脂肪酶和脂肪酸脱氢酶。由于石油能源资源有限，随着世界工业的快速发展，能源消耗急剧增长，全世界都面临着能源安全的问题。目前，已经开发的代用燃料可分为非含氧代用燃料和含氧代用燃料两大类，前者如天然气、液化石油气及氢能源等，后者包括二甲醚、醇类燃料及生物燃料等。这些燃料中，虽然天然气、液化石油气、氢均早已投入使用，但由于使用机械的内部构造以及燃料的补给及贮存等方面的问题，使得它们的应用范围受到很大的限制；二甲醚作为汽油的替代品，可以由一碳原料(如甲醇)直接合成，是一种很有发展前途的产品；醇类燃料如乙醇等也主要用作汽油的替代品种而使用，但成本较高；生物燃料主要用作柴油的替代品。生物燃料主要是指由植物中获取的燃料，还包括从其他可再生资源如动物脂肪和已经使用过的油和脂肪中提炼获取的燃料。其中植物油分子一般由14-18个碳的链组成， 与柴油分子的组成相似。但植物油单独用作柴油机燃料时，因粘度较大、热值较低、不饱和脂肪酸非常多，容易形成结胶，堵塞油路等缺点。因此植物油一般不能直接应用于内燃机， 必须经过改性处理。比较常见的改性方法有4种①直接混合法；②微乳液法；③高温裂解法；④酯交换法(即生物柴油)这是目前油脂改性的主要方法。生物柴油的主要成分是高级脂肪酸的低级醇酯，即软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等长链饱和或不饱及脂肪酸同甲醇或乙醇等醇类物质所形成的酯类化合物。目前，工业生产生物柴油主要是应用酯交换法。在油类酯交换反应中，甘油三酸酯与醇在催化剂作用下酯交换得到脂肪酸甲酯和甘油。因此制备一种生物柴油脂肪复合酶对生物柴油的发展具有重要意义。
技术实现思路
(1)采用截取少根根霉D6D脂肪酸脱氢酶基因，通过PCR扩增，构建表达载体，最后通过酿酒酵母表达，获得高产脂肪酸脱氢酶菌株。D6D脂肪酸脱氢酶是长链多不饱和脂肪酸合成的限速酶。由于天然菌种产酶能力较差，且性能不稳定，副产物多，分离相对比较困难，通常不能被直接用来产酶。为了能够找到高产、优质的菌种，目前国内外常采用基因重组技术克隆脂肪酸脱氢酶基因然后通过真菌表达生产，该法解决了一般的脂肪酸脱氢酶产生菌种培养困难、产酶效率低、酶活力不稳定等问题。利用RT-PCR和RACE方法，从少根根霉中得到全长为1482bp的一段cDNA序列3就，通过序列分析和已报道的D6D脂肪酸脱氢酶进行比较，结果显示其开放阅读框编码的氨基酸序列和卷枝毛霉、高山被孢霉和畸雌腐酶的D6D脂肪酸脱氢酶具有最大同源性。将编码序列构建重组表达载体，并转入酿酒酵母中表达，结果在添加外源性底物亚油酸以及半乳糖诱导后，经GC和GC-MS分析表明，重组细胞特异性的将亚油酸转化为GLA，GLA含量占总脂肪酸含量的3. 85%，初步表明该序列的表达产物具有D6D脂肪酸脱氢酶的功能。以上序列和功能分析结果表明，从少根根霉中所克隆的cDNA序列为新的D6D脂肪酸脱氢酶的基因，该项目技术填补了国内空白，技术水平国内领先。通过菌株扩大培养获得的高产脂肪酸脱氢酶菌株，经谱尼测试(北京)有限公司检测酶活力高达90万u/g以上，与现今技术水平获得的酶活力75万u/g，有显著的优异性。(2)采用紫外线光照、EMS及LiCl复合诱变青霉菌，定向扩大培养诱变菌株，发酵获得扩展青霉脂肪酶。对青霉菌进行紫外光照，选取生长旺盛菌落。用EMS溶液做成孢子悬浮液，加入 Na2SO3溶液，终止反应。稀释孢子悬浮液，再对其进行紫外光照，筛选旺盛菌种，涂布于含 LiCl双层筛选平板。如此反复两到三次，筛选出高产青霉菌种。扩展青霉种子培养基黄豆粉10g/L、葡萄糖10g/L、玉米淀粉10g/L、NaNO3 5g/ L、K2HPO4 5g/L、FeSO4 · 7H20 0. 06g/L、自然pH值；发酵基础培养基黄豆粉60g/L、玉米淀粉 10g/L、葡萄糖 10g/L、NaNO3 5g/L、FeSO4 · 7H20 0. lg/L、K2HPO4 3g/L、CaCO3 5g/L，自然 pH值。培养方法种子培养条件d6°C、150r/min、装料量30ml (250ml三角瓶)，振荡培养 60h ；发酵培养条件26°C、150r/min、接种量约为4%，装料量50ml (250ml三角瓶)，振荡培养114h。通过定向扩大培养获得的青霉脂肪酶，经谱尼测试(北京)有限公司检测，酶活力高达20000u/g，与现有技术水平获得的酶活力18000u/g相比，有显著的优异性。 (3)研究将脂肪酸脱氢酶与脂肪酶复配餐饮废油中含有大量的硬脂肪酸，采用单一的脂肪酶处理方法效果不是很理想， 需要采用复配脂肪酸脱氢酶来生产生物柴油。见说明书附1，由此可见，单种酶制剂对餐饮废油分解率80. 1%，而复合脂肪酶制剂分解率可高达92.2%。通过多次试验，获得最佳配比参数。如下表所示权利要求1.，其特征包括以下几个步骤(1)研究选取脂肪酸脱氢酶的DNA序列，并尝试在酿酒酵母中表达。D6D脂肪酸脱氢酶是长链多不饱和脂肪酸合成的限速酶。利用RT-PCR和RACE方法，从少根根霉中得到全长为1 482bp的一段cDNA序列就，通过序列分析和已报道的D6D脂肪酸脱氢酶进行比较，结果显示其开放阅读框编码的氨基酸序列和卷枝毛霉、高山被孢霉和畸雌腐酶的D6D脂肪酸脱氢酶具有最大同源性。将编码序列构建重组表达载体，并转入酿酒酵母中表达，结果在添加外源性底物亚油酸以及半乳糖诱导后，经GC和GC-MS分析表明，重组细胞特异性的将亚油酸转化为GLA，GLA含量占总脂肪酸含量的3. 85%，初步表明该序列的表达产物具有D6D脂肪酸脱氢酶的功能。以上序列和功能分析结果表明，从少根根霉中所克隆的cDNA序列为新的D6D脂肪酸脱氢酶的基因。脂肪酸先经脂肪酸脱氢酶脱氢转化成不饱和脂肪酸，然后再由脂肪酶生成脂肪酸甲酯。(2)青霉菌的诱变及定向扩大培养对青霉菌进行紫外光照，选取生长旺盛菌落。用EMS溶液做成孢子悬浮液，加入Na2SO3 溶液，终止反应。稀释孢子悬浮液，再对其进行紫外光照，筛选旺盛菌种，涂布于含LiCl双层筛选平板。如此反复两到三次，筛选出高产青霉菌种。(3)复合酶复配按照脂肪酶复合酶标准要求添加高酶活力的单酶复配，使脂肪酸脱氢酶和脂肪酶酶活力达到产品标准，添加载体，制成一种生物柴油专用复合酶。(4)复合酶的固定化经过研究表明采用聚乙二醇复合材料作为固定化酶的载体在稳定性、使用温度和转化率各方面都有较大的优势。2.如权利要求(1)所诉，其特征在于D6D脂肪酸脱氢酶的cDNA序列的截取，PCR扩增及表达。3.如权利要求(2)所诉，其特征在于采用EMS，紫外光照及LiCl复合诱变处理得到高产菌株。空浓缩后，喷雾干燥得到纯的纤维素复合酶。4.如权利要求( 所诉，其特征在于采用补加酶法的复配工艺来达到复合酶各种酶活要求指标。5.如权利要求(4)所诉，其特征在于采用聚乙二醇复合材料作为固定化酶的载体。全文摘要本专利技术提供了一种新的生物柴油专用脂肪复合酶的生产方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种生物柴油脂肪复合酶的制备方法，其特征包括以下几个步骤：（１）研究选取脂肪酸脱氢酶的ＤＮＡ序列，并尝试在酿酒酵母中表达。Ｄ６Ｄ脂肪酸脱氢酶是长链多不饱和脂肪酸合成的限速酶。利用ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ方法，从少根根霉中得到全长为１　４８２ｂｐ的一段ｃＤＮＡ序列就，通过序列分析和已报道的Ｄ６Ｄ脂肪酸脱氢酶进行比较，结果显示其开放阅读框编码的氨基酸序列和卷枝毛霉、高山被孢霉和畸雌腐酶的Ｄ６Ｄ脂肪酸脱氢酶具有最大同源性。将编码序列构建重组表达载体，并转入酿酒酵母中表达，结果在添加外源性底物亚油酸以及半乳糖诱导后，经ＧＣ和ＧＣ－ＭＳ分析表明，重组细胞特异性的将亚油酸转化为ＧＬＡ，ＧＬＡ含量占总脂肪酸含量的３．８５％，初步表明该序列的表达产物具有Ｄ６Ｄ脂肪酸脱氢酶的功能。以上序列和功能分析结果表明，从少根根霉中所克隆的ｃＤＮＡ序列为新的Ｄ６Ｄ脂肪酸脱氢酶的基因。脂肪酸先经脂肪酸脱氢酶脱氢转化成不饱和脂肪酸，然后再由脂肪酶生成脂肪酸甲酯。（２）青霉菌的诱变及定向扩大培养对青霉菌进行紫外光照，选取生长旺盛菌落。用ＥＭＳ溶液做成孢子悬浮液，加入Ｎａ２ＳＯ３溶液，终止反应。稀释孢子悬浮液，再对其进行紫外光照，筛选旺盛菌种，涂布于含ＬｉＣｌ双层筛选平板。如此反复两到三次，筛选出高产青霉菌种。（３）复合酶复配按照脂肪酶复合酶标准要求添加高酶活力的单酶复配，使脂肪酸脱氢酶和脂肪酶酶活力达到产品标准，添加载体，制成一种生物柴油专用复合酶。（４）复合酶的固定化经过研究表明采用聚乙二醇复合材料作为固定化酶的载体在稳定性、使用温度和转化率各方面都有较大的优势。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴菁，陈立丽，
申请(专利权)人：湖州珍采生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：33