本发明专利技术公开了一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗及其制备方法，属于基因工程疫苗领域。目前的疫苗产品主要包括草鱼呼肠孤病毒的组织浆灭活苗和体外细胞培养的减毒苗，生产成本高，只适合用注射的方式免疫。本发明专利技术以呼肠孤病毒外膜蛋白vp5和vp7为目标疫苗蛋白，公开了饲料添加剂形式的口服剂型疫苗及其制备方法。可用于呼肠孤病毒引起的草鱼出血病的防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程疫苗领域，尤其涉及一种用于治疗呼肠孤病毒引起的草鱼出血病的口服基因工程疫苗，及其制备方法。
技术介绍
草鱼具有生长快、个体大、产量高、饲料要求低特点，是当前较理想的节粮型池塘养殖品种，尤其在鱼饲料价格上升，池塘养殖成本增长的形势下，增加草鱼养殖比例，可增加池塘经济效益，具有现实意义。草鱼出血病是严重危害当年草鱼鱼种的一种传染性疾病。 这是一种流行广，季节长，发病率高，死亡率极高的一种疾病。草鱼出血病是影响我国草鱼养殖业可持续性发展的最主要病害之一。我国目前没有治疗草鱼出血病的有效药物，对该病主要靠免疫预防。市场上销售的疫苗产品主要包括草鱼呼肠孤病毒(Reovirus)的组织浆灭活苗和体外细胞培养的减毒苗。由于这两种疫苗的生产成本高，只适合用注射的方式免疫草鱼，不利于其大规模推广应用。用基因工程的方法利用微生物发酵技术研制的口服化疫苗显然会更加符合水生动物的特点，也有利于该疫苗的大规模推广应用。
技术实现思路
为了克服现有疫苗生产成本高，只适合用注射方式进行免疫的问题，本专利技术公开了一种用基因工程的方法，利用微生物发酵技术研制的口服化疫苗，及其制备方法。实现本专利技术目的的技术方案如下提供一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗，目标疫苗蛋白为呼肠孤病毒外壳蛋白 vp5和外壳蛋白vp7。所述的外壳蛋白vp5基因的扩增引物对为上游引物TCCCCCGGGGGATGGGGAACGTTCAAACCTCCGT和下游引物ATAAGAATGCGGCCGCTTATCACTTGCCGGGCCACAA ；外壳蛋白vp7基因的扩增引物对为上游引物CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC和下游引物ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC。本专利技术还提供一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)首先用RT-PCR的方法从呼肠孤病毒株感染的CIK细胞中，扩增出呼肠孤病毒株RNA基因组相应的cDNA ；再以所得的cDNA为模板，用PCR的方法扩增出外壳蛋白vp5基因和外壳蛋白vp7基因的全序列；其中外壳蛋白vp5基因的扩增引物对为 TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT 和 ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA ； 蛋白 vp7 基因的扩增引物对为 CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC 和 ACGCGTCGACGTCTT AATCGGATGGCTCCAC ；(2)构建表达外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7的原核表达质粒外壳蛋白vp5基因片段用Sma I和Not I双酶切后分别克隆到原核表达载体pGEX4T_3的相应位点中；外壳蛋白vp7基因片段用BamH I和Sal I双酶切后分别克隆到原核表达载体pGEX4T_3的相应位点中. (3)将上一步所得的阳性重组质粒pGEX_vp5和阳性重组质粒pGEX_vp7分别转化至表达菌株DH5 α中，得阳性表达菌株；(4)基于外壳蛋白νρ5和外壳蛋白νρ7的口服疫苗的制备将(3)所得的阳性表达菌株DH5 α灭活后，与鱼颗粒饲料混勻，再加入鱼肝油拌勻。其中，在步骤⑷中所述的阳性表达菌株DH5 α灭活方法为将步骤⑶所得的阳性表达菌株DH5 α 离心富集后首先用0.5%甲醛在20°C灭活，用IX PBS缓冲液洗涤除掉甲醛，最后用IX PBS 缓冲液重悬至使用浓度IO9个/ml ；所述的鱼颗粒饲料为0. 005-0. 05g/颗，优选为0. 02g/颗；所述的混勻为将鱼颗粒饲料与阳性表达菌株DH5 α菌悬液在冰上混合10_20分钟，优选为15分钟；阳性表达菌株DH5ci用量为每克饲料2-10ml，优选为5ml ；所述的鱼肝油的加入量为能防止入水后灭活的阳性表达菌株DH5 α向水中扩散的量。呼肠孤病毒是鱼类出血病的致病因子。呼肠孤病毒的基因组由11条双链RNA构成，并被两层蛋白质外壳包裹。最外层蛋白衣壳由νρ5和νρ7形成的二聚体构成，这两个蛋白质主要参与病毒对宿主细胞的识别与吸附。由于病毒外膜蛋白通常也是诱导宿主产生中和性抗体的蛋白质，所以本专利技术将νρ5和νρ7选定为目标疫苗蛋白，可以得到好的免疫效果ο本专利技术大肠杆菌表达系统高效表达νρ5和νρ7蛋白，可以降低疫苗生产成本。另一方面，本专利技术用饲料添加剂的形式研制疫苗的口服剂型，显然会更加符合水生动物的特点，也有利于该疫苗的大规模推广应用。附图说明图1外壳蛋白νρ5基因和外壳蛋白νρ7基因电泳图；图2外壳蛋白νρ5和外壳蛋白νρ7诱导表达结果；图3外壳蛋白νρ5和外壳蛋白vp7 Western-Blot免疫学检测结果；图4对照组和实验组草鱼的存活数。具体实施例方式应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例中，所涉及的部分材料来源如下病毒和细胞株草鱼呼肠孤病毒873株和草鱼肾细胞系CIK细胞均购于中国典型培养物保藏中心；草鱼肾细胞系CIK细胞培养基含10%小牛血清的DMEM细胞培养液，购于上海皓嘉科技发展有限公司，细胞的培养及病毒的感染与扩增都在27°C细胞培养箱(购于日本三洋电器集团)中进行。表达载体和菌种原核表达载体pGEX4T-3购自GE Healthcare公司，表达菌株 DH5 α、羊抗兔抗体及普通营养肉汤购自上海鼎国生物技术有限公司。DNA提取试剂盒和工具酶质粒微量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶，逆转录酶，连接酶和Taq多聚酶均购自TAKARA公司。蛋白分子量标记物、随机引物、逆转录缓冲液、dNTP、逆转录酶、Sma I和Not I双酶、BamH I和Sal I双酶、LB培养基平板、商品化鱼颗粒饲料、固体化学试剂均购自上海朝瑞生物工程有限公司；Trizol试剂、氯仿、异丙醇、普通营养肉汤、IPTG、甲醛、IX PBS缓冲液、鱼肝油、液态化学试剂均购自上海国药集团生化试剂有限公司。兔抗外壳蛋白vp5和外壳蛋白vp7血清由艾比玛特生物医药(上海)有限公司制 草鱼，平均体重100g，购自上海铜川路水产品批发市场。实施例一一、制备方法1、从草鱼呼肠孤病毒873株基因组中扩增外壳蛋白vp5基因和外壳蛋白vp7基因.首先用RT-PCR的方法从草鱼呼肠孤病毒873株感染的草鱼肾细胞系CIK细胞中扩增出草鱼呼肠孤病毒873株RNA基因组相应的cDNA，具体步骤为用草鱼呼肠孤病毒873株感染一瓶草鱼肾细胞系CIK细胞，72小时后收获草鱼肾细胞系CIK细胞，并用Trizol试剂和氯仿抽提草鱼肾细胞系CIK细胞中的总RNA，用异丙醇沉淀后所有的RNA溶入30 μ 1 超纯水中。约Iyg RNA用于后续的逆转录反应，反应总体积为20 μ 1，反应体系含Iyg RNA，ly 1随机引物(Takara)，2y 1 IOX逆转录缓冲液，1 μ 1 IOmM dNTP，1 μ 1逆转录酶。在42°C反应1小时后，反应管置于70°C灭活10分钟。以上述逆转录产物为模板，用 PCR的方法可以扩增出外壳蛋白vp5基因和外壳蛋白vp7基因的全序列。其中外本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种抗呼肠孤病毒口服基因工程疫苗，其特征在于，目标疫苗蛋白为呼肠孤病毒外壳蛋白ｖｐ５和外壳蛋白ｖｐ７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：和永杏，曹海鹏，吕利群，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：31
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