用氨基酸调控胶原基多孔支架降解速率的方法技术

本发明专利技术公开了用氨基酸调控胶原基多孔支架降解速率的方法，该方法以生物相容性好的氨基酸为交联桥联剂，将０．１～１００μＭ的氨基酸与胶原基多孔支架复合，进而采用碳化二亚胺类化合物进行交联处理，制备出降解速率可控且生物相容性好的胶原基多孔支架。本发明专利技术方法所用材料无毒副作用、来源广泛、成本低、制备工艺简单易行、条件温和、重复性好，所得的多孔支架能够满足不同组织和器官再生的需要，可广泛地应用于皮肤、软骨、骨、血管、神经、肌腱和心脏瓣膜等器官的再生与重建，在生物医学和组织工程等领域具有广泛的应用价值。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用氨基酸为交联桥联剂，在交联剂的作用下调控胶原基多孔支架降解速率的方法。
技术介绍
组织工程涉及医学、化学、生物学、材料学等多学科、多领域。在组织工程的研究中，支架材料的选择和支架的构建是其中的关键环节。胶原是哺乳动物结缔组织中的主要成分，构成人体约30％的蛋白质，在皮肤中的干重达72％。胶原有19种类型，最常见的是I型、II型和III型。其中I型最丰富，且性能优良，被广泛用于生物材料。胶原材料虽然具有无可比拟的生物相容性，但以纯胶原构建的支架的机械强度较低，降解速率过快，不能满足组织工程支架的要求。因此有必要通过适当的方法交联以提高胶原基多孔支架的交联度，并获得与组织再生相匹配的降解速率。目前，胶原基多孔支架的交联方法主要有物理交联和化学交联。物理交联法主要有真空干热交联、紫外线交联等。该类方法的特点是在交联过程中不引入其它物质，不会破坏胶原基多孔支架良好的生物相容性，但是单纯的物理交联不能达到所要求的交联度，胶原支架的降解速率仍然过快，不能与组织的再生速率相匹配。化学交联法应用比较广泛的化学交联剂主要有戊二醛，碳化二亚胺类以及双环氧类化合物。传统的纯化学交联法的缺点是对于交联度的调控通常比较困难，不能满足再生速率不同的各种组织和器官构建的要求；以戊二醛为交联剂时，戊二醛的残留会引起某些副作用，如细胞毒性。氨基酸是蛋白质的基本结构单元，具有良好的生物相容性。而且酸性氨基酸或碱性氨基酸分子中分别带有两个羧基或两个氨基，因此在胶原基支架的交联中可以作为交联桥联剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用氨基酸作为交联桥联剂来调控胶原基多孔支架降解速率的方法。本专利技术的，其步骤是先将胶原基多孔支架置于浓度为0.1～100μM的氨基酸溶液中浸泡0.01～100小时，然后将复合了氨基酸的胶原基多孔支架在0～100℃下于1～1000mM碳化二亚胺类化合物中进行交联1～48小时，即可。通过改变氨基酸的种类，氨基酸的比例以及交联剂的浓度可以调控胶原基多孔支架的降解速率。本专利技术中，对氨基酸种类没有特别的要求，通常采用赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天门东氨酸等。对碳化二亚胺类化合物也没有特别的要求，但最好采用水溶性碳化二亚胺，如1-乙基-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺(EDAC)。胶原基多孔支架是指纯胶原或复合了其它成分的多孔支架，如复合了氨基酸，多糖类化合物或复合了生长因子类化合物的多孔支架，所说的多糖类化合物，如壳聚糖、硫酸软骨素。生长因子类化合物，如骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、转化生长因子等。对所说的胶原来源没有特别的要求，可以是牛腱胶原、猪皮胶原或鼠尾胶原等。本专利技术方法所用的交联桥联剂具有良好的生物相容性和降解性能，无毒副作用，而且来源广泛，成本低廉，制备工艺简单易行、条件温和、重复性好。专利技术以氨基酸为交联桥联剂，通过改变氨基酸的种类，氨基酸的比例以及交联剂的浓度实现调控胶原基多孔支架的降解速率，所得的多孔支架能够满足不同组织和器官再生的需要，可广泛地应用于皮肤、软骨、骨、血管、神经、肌腱和心脏瓣膜等器官的再生与重建，在生物医学和组织工程等领域具有广泛的应用价值。附图说明图1为添加不同种类氨基酸对胶原基多孔支架降解程度的影响。支架在0.1mg/ml的I型胶原酶溶液(PBS，pH7.4)中、37℃消化12h后的结果。图2为胶原基多孔支架的降解度随谷氨酸浓度的变化关系。支架在0.5mg/ml的I型胶原酶溶液(PBS，pH7.4)中、37℃消化12h后的结果。图3为胶原基多孔支架的降解度随赖氨酸浓度的变化关系。支架在0.5mg/ml的I型胶原酶溶液(PBS，pH7.4)中、37℃消化12h后的结果。图4为胶原基多孔支架的降解程度随1-乙基-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDAC/NHS)浓度的变化关系。支架在0.1mg/ml的I型胶原酶溶液(PBS，pH7.4)中、37℃消化12h后的结果。图5为对照胶原支架和添加2.5μM赖氨酸交联后的胶原基多孔支架，在成纤维细胞作用下的体外收缩行为。细胞接种密度为500×104/ml。图6为添加2.5μM赖氨酸交联的胶原支架(罗丹明标记)种植成纤维细胞3天后的激光共聚焦显微镜照片。细胞接种密度为500×104/ml，荧光素二乙酸酯(FDA)染色。图7a为添加2.5μM赖氨酸交联的胶原支架种植成纤维细胞7天后的扫描电镜(SEM)照片。细胞接种密度为500×104/ml。图7b为添加2.5μM赖氨酸交联的胶原支架种植成纤维细胞21天后的SEM照片。细胞接种密度为500×104/ml。图8为添加2.5μM赖氨酸交联的胶原支架种植成纤维细胞21天后的组织切片照片(H&E染色)。细胞接种密度为500×104/ml。具体实施例方式通过下述实施例可以更好地理解本专利技术，但这些实例并不用来限制本专利技术。将来源于牛腱的I型胶原支架(2.5mg/块)置于24孔培养板中，分别添加1ml含2.5μM的甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)或赖氨酸(Lys)的2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)溶液(50mM，pH为5.5)，浸泡1小时；同时以添加三蒸水浸泡作为对照。然后分别加入1ml含有40mM的1-乙基-3-(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺(EDAC)，40mM的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的MES溶液，使最终的EDAC和NHS的浓度分别为20mM和10mM。在室温下交联24小时，交联后用三蒸水漂洗6次，每次10分钟。再经过冷冻干燥，即获得交联后的胶原基多孔支架。取未交联、未添加氨基酸交联、添加不同氨基酸交联的胶原基多孔支架，加入3ml的0.1mg/ml的I型胶原酶溶液(PBS，pH7.4)，于37℃恒温水槽中消化12h。吸取消化上清液1ml，置于聚合管中，加入2ml的6M的盐酸，封管后于120℃水解12小时。通过测定水解液的羟脯氨酸的含量来表征胶原多孔支架的降解度。未交联、未添加氨基酸交联、添加不同氨基酸交联的多孔支架的降解度见图1。将来源于牛腱的I型胶原支架(2.5mg/块)置于24孔培养板中，分别添加1ml的1～10μM谷氨酸的MES溶液(50mM，pH为5.5)，浸泡1小时；然后分别加入1ml含有40mM的EDAC，40mM的NHS的MES溶液，使最终的EDAC和NHS的浓度分别为20mM和10mM。在室温下交联24小时，交联后用三蒸水漂洗6次，每次10分钟。再经过冷冻干燥，即获得交联后的胶原基多孔支架。取添加不同浓度谷氨酸交联的多孔支架，加入3ml的0.5mg/ml的I型胶原酶溶液(PBS，pH7.4)，于37℃恒温水槽中消化12h。吸取消化上清液1ml，置于聚合管中，加入2ml的6M盐酸，封管后于120℃水解12小时。通过测定水解液的羟脯氨酸的含量来表征胶原多孔支架的降解度。谷氨酸的浓度对胶原基多孔支架的降解度的影响见图2。将来源于牛腱的I型胶原支架(2.5mg/块)置于24孔培养板中，分别添加1ml的0.67～100μM赖氨酸的MES溶液(50mM，pH为5.5)，浸泡1小时；然后分别加入1ml含有40mM的EDAC，40mM的NHS的MES溶液，使最终的EDAC和NHS的浓度分别为20mM和10mM。在室温下交联24小时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用氨基酸调控胶原基多孔支架降解速率的方法，其特征在于先将胶原基多孔支架置于浓度为０．１～１００μＭ的氨基酸溶液中浸泡０．０１～１００小时，然后将复合了氨基酸的胶原基多孔支架在０～１００℃下于１～１０００ｍＭ碳化二亚胺类化合物中进行交联１～４８小时。

【技术特征摘要】
1.一种用氨基酸调控胶原基多孔支架降解速率的方法，其特征在于先将胶原基多孔支架置于浓度为0.1～100μM的氨基酸溶液中浸泡0.01～100小时，然后将复合了氨基酸的胶原基多孔支架在0～100℃下于1～1000mM碳化二亚胺类化合物中进行交联1～48小时。2.根据权利要求书1所述的用氨基酸调控胶原基多孔支架降解速率的方法，其特征在于所说的氨基酸为赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天门东氨酸等。3.根据权利要求书1所述的用氨基酸调控胶原基多孔支架降...

【专利技术属性】
技术研发人员：高长有，马列，毛峥伟，沈家骢，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]