杀死孢子的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过使孢子与卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源接触而杀死或灭活孢子的方法。此外可以使该孢子与卤过氧化物酶增强剂接触。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及杀死或灭活孢子的酶促方法。背景已知可从需氧的芽孢杆菌(Bacilli)、厌氧的梭状芽孢杆菌(Clostridia)、选择的八叠球菌(sarcinae)和少数放线菌(actinomycetes)形成孢子。孢子在不带有任何代谢反应的方面类似于某些植物种子。在这点上，它们尤其适合忍受严峻的环境压力，且已知在长时间暴露于热、干燥、辐射和毒性化学药品之后可存活。这些性质使得尤其难以在会受到极端条件不利影响的环境如活组织或与活组织接触的物体等中杀死孢子。在70摄氏度中数分钟内可对真菌、病毒和病原细菌的营养细胞进行消毒；在100摄氏度可对许多孢子进行消毒。然而，一些腐生生物的孢子在煮沸数小时后仍可存活。加热是目前最常用的确保对孢子进行消毒的方法。孢子的外壳由包含多达孢子总蛋白质的80％的角蛋白样蛋白质组成。正是该蛋白质外壳负责孢子对化学消毒剂的抗性。微生物生活史的孢子阶段特征在于代谢休眠和对可破坏营养阶段的微生物的环境因素的抗性。细菌内生孢子和真菌孢子的萌发伴随着增加的代谢和对热与化学反应物降低的抗性。为发生萌发，孢子必须感知环境足以支持生长和繁殖。简单的α氨基酸可刺激孢子萌发。本专利技术提供了杀死或灭活孢子的改善的酶促方法。专利技术概述本专利技术提供了杀死或灭活孢子的方法，该方法包括使孢子与卤过氧化物酶(haloperoxidase)、过氧化氢源和碘化物离子源接触。在一个实施方案中，该卤过氧化物酶是氯过氧化物酶或溴过氧化物酶。在另一个实施方案中，该卤过氧化物酶是含有钒的卤过氧化物酶。在另外一个实施方案中，本专利技术的方法也包括使孢子与在下文中进一步进行表征的增强剂接触。专利技术详述卤过氧化物酶和展示卤过氧化物酶活性的化合物适合于整合入本专利技术方法中的卤过氧化物酶包括氯过氧化物酶、溴过氧化物酶和展示氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。卤过氧化物酶形成一类酶，该酶能够根据如下反应式在过氧化氢或生成过氧化氢的系统中将卤化物(Cl-、Br-、I-)氧化为相应的次卤酸其中X-是卤化物而HOX是次卤酸。卤过氧化物酶根据其对卤化物离子的特异性进行分类催化从氯化物离子形成次氯酸盐、从溴化物离子形成次溴酸盐和从碘化物离子形成次碘酸盐的氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)；和催化从溴化物离子形成次溴酸盐和从碘化物离子形成次碘酸盐的溴过氧化物酶。然而，次碘酸盐自发地歧化为碘，因而碘是观察到的产物。这些次卤酸盐化合物随后可以与其他化合物进行反应而形成卤化化合物。已从各种生物中分离卤过氧化物酶哺乳动物、海洋动物、植物、藻类、地衣、真菌和细菌。普遍接受的是卤过氧化物酶是自然界中负责形成卤化化合物的酶，尽管可能涉及其他的酶。卤过氧化物酶已从许多不同的真菌中分离，特别是从真菌暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycetes)类中分离，该类例如卡尔黑霉属(Caldariomyces)如C.fumago、链格孢属(Alternaria)、弯孢霉属(Curvularia)如C.verruculosa和不等弯孢(C.inaequalis)、Drechslera、Ulocladium和葡萄孢属(Botrytis)。也已从细菌中分离了卤过氧化物酶，例如假单胞菌属(Pseudomonas)如吡咯菌素假单胞菌(P.pyrrocinia)和链霉菌属(Streptomyces)如金霉素链霉菌(S.aureofaciens)。在一个优选的实施方案中，卤过氧化物酶是源自弯孢霉属物种的钒卤过氧化物酶(即含有钒或矾酸盐的卤过氧化物酶)，所述物种特别是C.verruculosa和不等弯孢，如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS102.42，如由WO 95/27046图2中的DNA序列编码的钒卤过氧化物酶(全文引入作为参考)；或者如描述于WO 97/04102中的C.verruculosa CBS147.63或C verruculosa CBS 444.70。在另一个优选的实施方案中，卤过氧化物酶是含有矾的卤过氧化物酶，如钒氯过氧化物酶。钒氯过氧化物酶可源自WO 01/79459中的Drechslerahartlebii、描述于WO 01/79458中的Dendryphiella salina、描述于WO01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或描述于WO 01/79460中的棉丝菌属(Geniculosporium sp.)。钒卤过氧化物酶更优选地源自Drechslerahartlebii(DSM 13444)、Dendryphiella salina(DSM 13443)、Phaeotrichoconis crotalarie(DSM 13441)或棉丝菌属物种(DSM 13442)。卤过氧化物酶的浓度一般在0.01-100ppm酶蛋白质的范围内，优选地为0.05-50ppm酶蛋白质，更优选地为0.1-20ppm酶蛋白质且最优选地为0.5-10ppm酶蛋白质。卤过氧化物酶活性的确定通过如下步骤进行微量滴定测定，即，将100μl卤过氧化物酶样品(约0.2μg/ml)与100μl0.3M pH7的磷酸钠缓冲液-0.5M溴化钾-0.008％苯酚红混合，将溶液加入到10μl0.3％的H2O2中，并测量作为时间的函数的595nm的吸收。应用一氯双甲酮(Sigma M4632，290nm时ε＝20000M-1cm-1)作为底物的测定进行如下。作为时间的函数对290nm吸收的降低进行测量。应用浓度为约1μg/ml的卤过氧化物酶在0.1M磷酸钠或0.1M乙酸钠、50μM一氯双甲酮、10mM KBr/KCl和1mM H2O2中进行该测定。将HU定义为每分钟在pH5和30℃氯化或溴化的1微摩尔一氯双甲酮。过氧化氢源卤过氧化物酶需要的过氧化氢源可为过氧化氢或原位产生过氧化氢的过氧化氢前体。任何溶解时可释放卤过氧化物酶能应用的过氧化物的固体实体均可充当过氧化氢源。在溶解于水或适当的基于水的介质时可产生过氧化氢的化合物包括但不局限于金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧化酯、过氧化脲、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。生成可被卤过氧化物酶应用以氧化碘化物的过氧化物的任何化合物均是本专利技术可接受的过氧化氢源；这包括大量本领域技术人员可意识到的化合物。也可应用这些物质之两种或多种的混合物。另一个过氧化氢源是生成过氧化氢的酶系统，如氧化酶及该氧化酶的底物。氧化酶和底物的组合的例子包括但不局限于氨基酸氧化酶(参见如US 6,248,575)和适当的氨基酸、葡萄糖氧化酶(参见如WO 95/29996)和葡萄糖、乳酸氧化酶和乳酸、半乳糖氧化酶(参见如WO 00/50606)和半乳糖，以及醛糖氧化酶(参见如WO 99/31990)和适当的醛糖。通过研究EC1.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._和EC1.5.3._或类似的种类(按国际生物化学协会(International Union of Biochemistry))，本领域的技术人员易于识别这种氧化酶和底物的组合的其他例子。过氧化氢源可在过程开始时或过程中添加，如一般添加的量相应于0.001mM～25mM的水平，优选地为0.005mM～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杀死或灭活孢子的酶促方法，该方法包括使孢子与卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源接触。

【技术特征摘要】
DK 2001-12-4 PA2001017991.一种杀死或灭活孢子的酶促方法，该方法包括使孢子与卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源接触。2.权利要求1的方法，其中卤过氧化物酶是氯过氧化物酶或溴过氧化物酶。3.权利要求1的方法，其中卤过氧化物酶是含有钒的卤过氧化物酶。4.权利要求1的方法，其中碘化物离子源是碘化物盐。5.权利要求1的方法，该方法还包括使孢子与增强剂接触。6.权利要求1的方法，该方法还包括使孢子与表面活性剂接触。7.权利要求1-6中任何一项的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：S丹尼尔森，BE克里斯腾森，
申请(专利权)人：诺和酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]