新型生物农药——松刚霉素生产方法技术

一种新型生物农药－松刚霉素生产技术，涉及农作物真菌病虫害生物药制备。本技术以大米为原料，以含ＮａＣｌ、ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、ＮａＮＯ↓［３］ＦｅＳＯ↓［４］的液体为营养液制备培养基；以荨麻青霉为菌种，接种培养后菌丝用有机溶剂萃取得萃取液，以４－（Ｐ－叠氮水扬基氮基）丁胺为交联剂，在ＵＶ照射下与母核萃取液进行羧基反应，然后将羧基反应物真空浓缩，得晶种后将晶种与水溶液溶解得水性成品。本发明专利技术产品具有高效抗真菌性能，对人体无毒害，对环境无残留、无污染。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物农药
，特别涉及用于农作物真菌病虫害生物农药制备技术。
技术介绍
在植物病害中，真菌病害种类最多，约有3万种，其中许多还是为害最严重的，如禾谷类的锈病是世界性重要病害。几乎每种作物上都可以发现几种甚至几十种真菌病害，如水稻上发现的真菌病害在200种以上，其中常见的真菌病害在30种以上。各种作物常见的锈病、黑粉病、白粉病和霜霉病都是真菌引起的。目前，上述病害的防治多数仍使用化学农药，不但致使诸多致病菌产生耐药性，用药量不断地加大，残留量增高；而且由于长期使用化学农药，导致造成对环境的污染以及对人体的危害。所以传统的化学农药已成为人畜的一种新杀手。另外，由于大量使用高残留的化学农药，已引起了农畜产品残留严重超标，导致出口受阻。现有生物农药品种结构不合理，仅限于生物杀虫剂，如Bt等和抗细菌农用抗生素，如井冈霉素、春雷霉素和农用链霉素等，而抗真菌生物农药起步甚晚，尚无高效、广谱品种，且处于试用阶段，如中生菌素和武夷霉素等。从总体上看，目前生物农药在整个农药中所占的比例还较小，而抗真菌生物农药几乎是空白，加速抗真菌生物农药的研发已成为世界上发展生物农药的一种趋势和方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于采用固体发酵新工艺生产松刚霉素母核—一种具有高效抗真菌性能的非多烯类医用灰黄霉素分子结构，实施基团甲基羧化使该农药对人体无毒害、对环境无残留、无污染，具有非常良好的生物相容性。本专利技术目的可通过以下技术方案实现。本专利技术采用以大米为主要原料的固体发酵生产具有抗真菌性能的非多烯类含氯化合物母核技术，对该母核甲基(CH3)实施羧化，使其基团发生改变，实现松刚霉素由非水溶性转为水溶性，使制剂水溶化。提高叶面的附着力，增强对真菌的抑制力。松刚霉素(SoGamycin)是从荨麻青霉(Penicillium Patulum)培养液得到的一种非多烯类含氯产物作为母核，实施甲基(CH3)羧化，呈水溶性荨麻青霉。该菌种的公开已记载文献1)吴松刚等 中国抗生素杂志4(6)12-14 19792)吴松刚等 中国医药工业3(2)14 19793)吴松刚等 微生物通报(3)10 19794)吴松刚等 微生物通报6(3)10-12 19705)吴松刚等 微生物通报 10(5)202-206 19836)吴松刚等 遗传2(4)16-18 1990福建师范大学学校(自然科学版)12(2)88-92 19967)吴松刚等 药物生物技术2(4)28-32 1995该菌种的商业公开途径中国科学院微生物研究所松刚霉素母核分子结构见图1，物理性状为白色粉末，无臭，味微苦，溶点为218-224℃，具有强烈的抗真菌活性，甲基羧化后，实现水溶性特性，提高了在叶面的附着力，增强了对致病真菌的杀菌作用，其作用机理是松刚霉素大量被致病真菌吸收后，与其细胞的脂肪结合，不与DNA与RNA结合，达到抑制致病真菌的作用。可用于防治多种植物病害，诸如炭疽病，叶斑病，白粉病，霜霉病和枯萎病等。松刚霉素母核采用现代固体发酵技术—厚层好氧发酵，使其细胞内大量累积母核固有有效成份，大幅度节约能源，经溶媒萃取后，进行甲基羧化，其羧化过程为在一端含有一个一级胺，另一端有一个光敏感性的苯基叠氮基(Picrce)，4-(P-叠氮水扬基氮基)丁胺(ASBA)这种交联剂不会自发地与羧基反应，必须利用另一个试剂来促进键的形成，它不与碳化二亚胺和其他这样的能启动与一个受体羧后形成键合的试剂体系相结合使用，一个水溶性的碳化二亚胺如EDC，是用以激活一逐步形成靶标分子上的羧基。形成活性酯中间体，如图3。在ASBA(图2)存在的情况下，衍生化会发生，导致酰胺键的形成，从而产生一个光反应基团进行的修饰。ASBA的交联剂提供了一个相当长的间隔基(16.3A)。它的苯基叠氮部分是由一个水扬酸的衍生物构建的，因而具有一个激活环的羧基，这个基团的存在，使得在交联之前对环进行放射性碘化作用，在光解步骤被启动之前，这个试剂应在黑暗之中操作，或是采用避光处理，以防止苯基叠氮基因的降解。本专利技术的母核生产方法的主要特点在于其一、以大米为主要原料，无需外源酶解，蒸熟灭菌，即可使用。其二、采用液体种，厚层通风固体发酵工艺，料厚可达20cm，需翻动通风培养。其三、母核有效成份全部积累在细胞内，发酵效价可达60000u/g以上。经有机溶剂萃取后，即可进行甲基羧化。见附图3所示。本专利技术的母核甲基羧化工艺，以ASBA为关键的交联剂，实现母核由非水溶性转为水溶性，本生产方法主要特点在于其一、母核甲基基团的改造，选择生物藕合技术，而ASBA作为羧基反应性的交联剂。取得了理想的结果。其二、ASBA含有一个一级胺基团，利用碳化二亚胺EDC，可藕合含羧基的化合物，在UV的照射下，启动光活化反应，导致共价的交联取得成功。其三、由于母核甲基羧化，实现由非溶性到水溶性的转换，从根本上解决了作为农业杀菌剂对剂型的要求，并增强了其抗菌作用。附图说明图1为松刚霉素分子结构图；图2为松刚霉素前体固体发酵原理流程图；图3为母核甲基羧化原理图；图4为母核甲基羧化流程图；图5为松刚霉素紫外光谱图；本专利技术结合附图各实施例作如下进一步的说明附图1中，为本专利技术母核的分子结构，它无异于作为医用灰黄霉素的分子结构，是一种具有强烈的抗真菌性能的非多烯类抗生素，理化性质均按我国2000年版药典所述。附图2中，本工艺主要原料为大米，液体种的接种量为15％，28℃培养，料层厚20cm，翻动通风发酵，发酵周期200-240hr，萃取有机溶剂为丙酮。含量可达300000u/ml，可套用。附图3、4、5中，本工艺以4-(P-叠氮水扬基氮基)丁胺为交联剂，在UV照射下，与母核萃取液进行羧基反应，ASBA的浓度为0.3％，搅拌时间30’，即可完成全过程。实施例1本专利技术的生产菌株为高度耐前体生产变株，发酵配方为大米∶营养液＝1∶0.8营养液中含Nacl 5％KH2PO40.2％NaNo30.6％ FeSo40.002％PH 自然液体种接种量按15％接入大米培养基，28℃，200-240hr本专利技术固体菌丝培养物，经100℃烘干，用丙酮进行萃取，萃取柱单管套用，萃取液母核含量到300000u/ml即可终止。实施例2本专利技术的母核甲基羧化工艺，主要在反应釜中进行，该反应釜特点为避光、带搅拌、带紫外灯的5M3罐装置，温度为常温条件，交联剂浓度为0.3％，交联反应时间为30′，终止后，进行真空浓缩760mmhg浓缩到晶体形成。晶体干燥100℃烘干2hr，水份＜2％，作为晶种进行配制水溶性制剂。本专利技术主要优点和效益(1)选择深层固体发酵新工艺，生产松刚霉素母核——医用灰黄霉素分子结构，较深层液体发酵工艺，电耗，能耗大幅度下降，其发酵效价高达60000u/g，从而使生产成本显著下降，为农用奠定了重要的经济基础。(2)本专利技术采用对医用灰黄霉素分子结构基团甲基羧化工艺，从根本上解决了由非水溶性的农用品质要求，使农用化得以实现。(3)松刚霉素的问世，以其无毒害、无公害、高效、广谱、安全、低成本的独特优势，而逐步代替化学农药，将会取得巨大的经济效益和社会效益。松刚霉素的应用试验1 1引言本试验目的在于检测新型抗真菌生物农药——松刚霉素对甜瓜镰刀菌的抑菌作用，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
新型生物农药－松刚霉素生产技术，其特征在于本技术的生产步骤为：①固体培养基的制备：ａ．选择大米为原料；ｂ．以含ＮａＣＬ４～６％，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．１～０．３％，ＮａＮＯ↓［３］０．４～０．７％，ＦｅＳＯ↓［ ４］０．００１．００３％的液体为营养液；ｃ．将大米与营养液以重量比为１∶０．８的比例混匀蒸熟；ｄ．将混匀蒸熟料在１２１℃压力下灭菌３０分钟，得大米固体培养基；②接种：ａ．选用荨麻青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｍ　 　Ｐａｔｕｌｕｍ）液体菌种；ｂ．在大米固体培养基中接种，接种量为１５％，在２５～３０℃培养，料层厚１５～３０ｃｍ，翻动通风发酵，发酵固期２００～２４０ｈｒ；ｃ．将培养物固体菌丝用有机溶剂丙酮萃取；得含量可达３０００００ｕ／ｍ ｌ的萃取液备用；③甲基羧化处理：以４－（Ｐ－叠氮水扬基氮基）丁胺为交联剂，在ＵＶ照射下，与母核萃取液进行羧基反应，反应过程交联剂的浓度为０．３％，搅拌时间为２０～４０分钟得羧基化反应物；④水溶性制剂的制备；ａ ．将羧基反应物在７６０ｍｍｈｇ下真空浓缩得晶体；ｂ．将所得晶体在９０～１１０℃下烘干，至水份小于２％，得晶种；ｃ．将晶种与水溶液溶解，得水溶性制剂。...

【技术特征摘要】
1.新型生物农药——松刚霉素生产技术，其特征在于本技术的生产步骤为①固体培养基的制备a.选择大米为原料；b.以含NaCL4～6％，KH2PO40.1～0.3％，NaNO30.4～0.7％，FeSO40.001.003％的液体为营养液；c.将大米与营养液以重量比为1∶0.8的比例混匀蒸熟；d.将混匀蒸熟料在121℃压力下灭菌30分钟，得大米固体培养基；②接种a.选用荨麻青霉(Penicillinm Patulum)液体菌种；b.在大米固体培养基中接种，接种量为15％，在25～30℃培养，料层厚15～30cm，翻动通风发酵，发酵固期200～240hr；c.将培养物固体菌丝用有机溶剂丙酮萃取；得含量可达300000u/ml的萃取液...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴松刚，刘波，施巧琴，王剑英，
申请(专利权)人：深圳市绿微康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]