提供了改善细菌与靶基质的粘附和/或改善细菌的应激耐受力的方法和组合物。方法包括使细菌暴露于粘附适应性条件且从而增加细菌的粘附活性和/或应激耐受力。进一步提供的是具有调节生产的自诱导物-2的细菌。组合物包括表达涉及自诱导物-2生产途径的核酸分子的重组细菌。进一步提供的是自诱导物-2相关的融合蛋白、抗原肽、抗体和载体。进一步提供的是筛选将刺激自诱导物-2生产和/或产生粘附适应性应答的化合物或环境条件的方法，以及用于使细菌增加粘附和/或应激耐受力的各种方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌，特别是益生菌和乳酸菌，以及用于控制其中的细胞信号传导的方法和构建体。
技术介绍
在小肠中，乳酸杆菌代表共生微生物区系的主要和重要组分。各种乳酸杆菌 (Lactobacillus)种类已用作益生菌培养物，基于需要来自那种生物的特定利益和制造商所需的生物工艺特征，选择用于在食物或饮食辅助物中使用。所有益生菌培养物并不显示相同的特征，使得选择这些菌株和澄清其利益是极为重要的。乳酸菌且特别是乳酸杆菌是为了一系列预期的健康促进因素包括在食品中的常见种类。乳酸菌(LAB)在各种环境小生境中天然发现，在所述小生境中它们作为复杂的微生物群落的成员存在。在每种小生境中的存活取决于该生物对各种条件的感觉和应答能力，所述条件例如温度、PH、营养物可用性、和细胞群体密度。LAB经常占据的一种主要小生境是哺乳动物的胃肠道(GIT)。多重信号转导途径可能控制粘着因子、应激应答基因和其他遗传决定子的表达，它们促进LAB在GIT的各种区室内的存活和竞争。某些肠乳酸杆菌连同革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌一起具有与肠上皮和其中的粘膜层结合的能力。这种结合被认为对于实现某些益生特性是重要的，所述益生特性包括竞争排斥、免疫调节、和递送生物治疗药物。尽管这种结合中涉及的分子机制仍未明了，但显然该过程是复杂的，涉及宿主-特异性、细菌-特异性、和环境因素。某些肠乳酸杆菌连同革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌一起具有与肠上皮和其中的粘膜层结合的能力。定居这些表面的能力可以使益生菌获得超过其他固有和病原性微生物区系的显著优点。特别感兴趣的是这些细菌借以存活且潜在定居肠道的动态环境的机制。影响粘附的某些环境因素已得到研究，所述环境因素包括PH、生长期、和其他微生物的存在。乳酸杆菌必须维持满足其自身生长需求以及经受得住不利条件之间的平衡， 所述不利条件包括胃酸冲击、被宿主防御呈递和竞争微生物区系(Tarmock000 Appl. Environ. Microbiol. 71 :8419-8425)。然而，关于这些应激物如何影响乳酸杆菌与肠环境中的各种基质结合的能力知之甚少。专利技术简述提供了改善细菌与靶基质的粘附和/或改善细菌的应激耐受力(stress tolerance)的方法和组合物。方法包括使细菌暴露于粘附适应性条件(adhesion adaptive condition)且从而增加细菌的粘附活性和/或应激耐受力。进一步提供的是具有被调节水平的自诱导物-2(ΑΙ1)的细菌。组合物包括表达参与自诱导物-2生产途径的核酸分子的重组细菌。进一步提供的是自诱导物-2相关的融合蛋白、抗原肽、抗体和载体。进一步提供了筛选将刺激自诱导物-2生产和/或产生粘附适应性应答的化合物或环境条件的方法， 以及使用具有增加的粘附和/或应激耐受力的细菌的各种方法。本专利技术在本文的附图和下文所述说明书中进一步详细说明。附图简述附图说明图1表示如显微镜观察到的，嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)NCFM在体外与Caco_2 细胞的粘附。细菌细胞(a)在未浓缩的条件(lxl08CFU/ml)下于37°C孵育1小时，或(b) 形成团块且在IOX浓缩的条件(lxl09CFU/ml) (AAR条件)下于37°C孵育1小时。图2描述了粘附方案。图3表示在标准孵育条件(实心棒)和粘附适应性条件(条纹棒)下，突变株和 NCFM =IacL对照菌株对Caco-2细胞的粘附特性。计数表示为平均细菌粘附/显微镜视野，且误差棒表示相对于平均值的1个标准差。图4显示在嗜酸乳杆菌NCFM中由甲硫氨酸生产AI_2的途径。对于AI_2生产必需的中间产物以粗体表示，且编码每种酶的ORF在酶名称下列出。SAM-依赖性甲基转移酶缩写为SAM-MT。最后步骤涉及4，5-二羟基-2，3-戊二酮非酶促环化成AI-2。图5显示与NCFM =IacL对照菌株比较，嗜酸乳杆菌NCFM的LuxS—突变株与Caco_2 细胞的粘附能力。图6显示如从无菌中和上清液(条纹棒)中检测的，在嗜酸乳杆菌NCFM的生长期间产生的AI-2，且表示为亲本株的平均荧光/LuxS_突变株的平均荧光。由OD6tltl表示的嗜酸乳杆菌NCFM生长(带圆圈的实线)以及PH的下降(带三角的虚线)，与对数生长期间 AI-2的快速生产一致。每个值表示一式三份实验的平均值，且误差棒是相对于平均值的1 个标准差。图7表示暴露和不暴露于粘附适应性条件的对照菌株和所选嗜酸乳杆菌NCFM突变株的粘附特性。图8的图表是在野生型(图A)或LuxS-突变株(图B)中过表达的总ORF的COG 分类。饼形图中列出了 COG群(图C)以及那个群中过表达的ORF的编号(C0G，0RF的#)。图9显示从(A)对数早期到中期或(B)从对数中期到晚期表达增加(无斜杠)或减少(斜杠)的ORF的编号。野生型由白色棒表示且LuxS-突变株由灰色棒表示。图10表示在对数生长早期(0D_0. 2)、对数生长中期(0D_0. 7)和对数生长晚期 (OD600L 2)收获的嗜酸乳杆菌NCFM(无斜杠)和LuxS-突变株(斜杠)的胆汁耐受力。将细菌群体进行稀释并在补充0.75% (白色棒)、1.0% (灰色棒)或2.0% (黑色棒)牛胆汁(Oxgall)的MRS上铺板。存活百分比通过与在无补充的MRS上生长的CFU/ml比较来计算。通过斯氏t检验(Student，s t test) (P < 0. 05)检测的显著差异由星号(*)表示。 误差棒是相对于平均值的1个标准差。图11表示在对数生长早期OD6J). 2 (图A)、对数生长中期OD6J). 7 (图B)和对数生长晚期0D_1.2(图C)收获时，于55°C热应激后野生型(开环)和LuxS-(闭环)群体的存活。星号(*)指示对于那个时间点已检测到统计学显著差异(P <0.05)。误差棒表示相对于平均值的1个标准差。专利技术详述本专利技术现在将在下文中参考附图更充分地描述，其中显示了本专利技术的某些但并非5全部实施方案。事实上，本专利技术可以以许多不同形式体现且不应被解释为限制于本文所述实施方案；更正确地，提供这些实施方案从而使得本公开内容将满足可应用的合法要求。自始至终相同的编号指相同的元件。有前文说明书和附图中呈现的教导的帮助，本文所述的本专利技术的许多修改和其他实施方案对于本专利技术所属领域的技术人员将是显而易见的。因此，应当理解本专利技术并不限于公开的具体实施方案，并且修改和其他实施方案预期包括在所附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语，但它们仅以一般和描述性意义而不是为了限制性的目的使用。如本文使用的，如说明书和权利要求自始至终所使用的，“a”、“an”和“the”可以是单数或复数的。例如细胞可以指单个细胞或多个细胞。同样如本文使用的，“和/或”指包含一种或多种所列项目的任何和所有可能组合， 以及当以选择性解释(“或”)时缺乏组合。I.概况提供了改善细菌与靶基质的粘附和/或改善细菌的应激耐受力的方法和组合物。 共生生物例如益生菌对胃肠道或泌尿生殖道的细胞的粘附增加可以减少肠、泌尿生殖道和创伤部位的感染危险。类似地，改善益生生物的应激耐受力从而使得益生菌的存活率在肠道的苛刻环境中增加，将进一步帮助减少肠、泌尿生殖道和创伤部位的感染危险本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种诱导或增强细菌中的自诱导物－２的生产的方法，其包括将至少２种异源核酸分子引入所述细菌中，所述异源核酸分子选自：（ａ）（ｉ）包含如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中所示核苷酸序列的核酸分子；（ｉｉ）在严格条件下与（ａ）（ｉ）的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于３７℃在５０％甲酰胺、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中杂交，和于６０℃－６５℃在０．１ＸＳＳＣ中洗涤；（ｉｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中所示核苷酸序列具有至少９０％同一性的核酸分子；或（ｉｖ）编码与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２具有至少９０％同一性的多肽的核酸分子；（ｂ）（ｉ）包含如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中所示核苷酸序列的核酸分子；（ｉｉ）在严格条件下与（ｂ）（ｉ）的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于３７℃在５０％甲酰胺、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中杂交，和于６０℃－６５℃在０．１Ｘ ＳＳＣ中洗涤；和（ｉｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中所示核苷酸序列具有至少９０％同一性的核酸分子；或（ｉｖ）编码与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４具有至少９０％同一性的多肽的核酸分子；（ｃ）（ｉ）包含如ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１５中所示核苷酸序列的核酸分子；（ｉｉ）在严格条件下与（ｃ）（ｉ）的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于３７℃在５０％甲酰胺、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中杂交，和于６０℃－６５℃在０．１ＸＳＳＣ中洗涤；和（ｉｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５中所示核苷酸序列具有至少９０％同一性的核酸分子；或（ｉｖ）编码与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６具有至少９０％同一性的多肽的核酸分子；（ｄ）（ｉ）包含如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１中所示核苷酸序列的核酸分子；（ｉｉ）在严格条件下与（ｄ）（ｉ）的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于３７℃在５０％甲酰胺、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中杂交，和于６０℃－６５℃在０．１ＸＳＳＣ中洗涤；和（ｉｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１中所示核苷酸序列具有至少９０％同一性的核酸分子；或（ｉｖ）编码与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２具有至少９０％同一性的多肽的核酸分子；和（ｅ）（ｉ）包含如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３中所示核苷酸序列的核酸分子；（ｉｉ）在严格条件下与（ｅ）（ｉ）的核酸的互补物杂交的核酸分子，所述严格条件包括于３７℃在５０％甲酰胺、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中杂交，和于６０℃－６５℃在０．１ＸＳＳＣ中洗涤；和（ｉｉｉ）与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３中所示核苷酸序列具有至少９０％同一性的核酸分子；（ｉｖ）编码与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４具有至少９０％同一性的多肽的核酸分子；其中所述细菌比相应的对照细菌产生更多量的自诱导物－２。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·L·巴克，A·阿斯卡拉特佩里尔，T·R·克莱哈默，E·阿尔特曼，
申请(专利权)人：B·L·巴克，A·阿斯卡拉特佩里尔，T·R·克莱哈默，E·阿尔特曼，
类型：发明
国别省市：US
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