连接目标序列的方法技术

本发明专利技术涉及连续目标序列的方法。多重重叠-延伸RT-PCR提供了在单一反应中连接两个或者更多杂聚蛋白结构域或者亚基编码核苷酸序列的有效方法。特别地，来自例如免疫球蛋白、T细胞受体或者B细胞受体的可变区编码序列的连接通过使用本发明专利技术的方法而被简化。这产生了更为有效的制备可变区编码序列文库的方法。使用来自分离的单一细胞的模板进行多重重叠-延伸RT-PCR的能力使得能够以高通量形式产生关联对文库。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是多重分子扩增步骤，它能够将与扩增有关的目标核苷酸序列连接起来，特别是聚合酶链式反应(多重PCR)。该方法特别有利地用于产生来自免疫球蛋白、T 细胞受体或者B细胞受体可变区编码序列的关联对(cognate pair)文库以及组合文库。
技术介绍
哺乳动物中存在的参与免疫应答的抗原结合蛋白是表现出广泛多样结合特异性的多克隆大集合。这种多样性是通过编码这些结合蛋白可变区的基因序列的重排产生的。 这些可变区结合蛋白包括可溶性的和膜结合形式的B细胞受体(也称为免疫球蛋白或者抗体)以及膜结合的T细胞受体(TcR)。就免疫球蛋白而言，在抗原通过B细胞抗原受体借助被称为亲和成熟的过程(该过程涉及了这些可变基因体细胞超变的循环)被识别之后，免疫球蛋白的亲和性增强。值得注意的是，已经对免疫球蛋白或者其片段例如Fab片段、Fv片段和单链 Fv(SCFV)分子进行克隆和重组表达。但是所有其他的可变区结合蛋白原则上也可以使用与对于抗体相同的概念进行克隆和表达。具有所需结合特异性的抗体的已知分离方式经常涉及来自被免疫宿主的杂交瘤的制备，接下来对特异克隆进行筛选，或者涉及在大肠杆菌中制备由免疫球蛋白可变区结构域组成的组合表达库，接下来使用例如噬菌体展示的技术对组合表达库进行富集。用于制备治疗性抗体的杂交瘤技术在使用中一个主要的限制是没有适宜作为人B 淋巴细胞融合伴侣的人淋巴瘤。异源杂交瘤(即人B细胞与小鼠淋巴瘤的融合)极为不稳定，因此几乎不能产生用于生产目的的适宜细胞系。通过用EB病毒感染无限增殖化的人B 细胞表现出类似的不稳定性。缺乏稳定可靠的制备用于治疗的人抗体的细胞学方法可以使用分子生物学中更为最近的进展得到补偿。使用组合文库和噬菌体展示可以产生大的抗体克隆集合，可能的多样性超过了 IO100从这个集合中可以就与特异靶标结合进行筛选，这样产生亚文库。可以使用该亚文库制备多克隆或者单克隆抗体。可以从淋巴细胞、浆细胞、杂交瘤或者任何其他表达免疫球蛋白的细胞群中扩增出构成文库的可变区编码序列(例如免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区编码序列)。制备组合文库的当前技术包括从细胞群中分别分离可变区编码序列。这样，例如免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的编码序列的原始配对就会丢失。但是在组合文库中所述的序列随机配对，且这些可变序列的原始组合仅仅会随机出现。因此，为了分离负责所需结合特异性的可变区编码序列，需要相当大量的筛选。这通常与表达所需特异性的克隆的富集方法，例如核糖体展示或者噬菌体展示联合进行。即使是这样，所获得的多样性对于分离产生与那些在原来细胞中发现的结合蛋白具有类似高度亲和性的结合蛋白的可变区编码序列对，可能仍然不够大。而且，通常用于筛选组合文库的富集步骤引入了很大的偏倚性(bias)，例如偏好大肠杆菌中非常低毒性的多肽、有效的折叠、缓慢的关闭速率(off-rate)或者其他系统依赖的参数，这进一步降低了文库的多样性。此外，来源于这种组合文库的克隆更易于产生出与自身抗原发生交叉反应的结合蛋白，因为与原始对(此后称为关联对(cognate pair))相反，他们从未经历过体内针对自身抗原的负选择，对于B和T 淋巴细胞受体发育过程中的特定阶段就有负选择出现。因此克隆可变区编码序列的原始配对就是合意的方法。而且，在关联对文库中出现表达所需结合特异性的克隆的频率要比在通常的组合文库中出现所需特异性的频率高很多，特别是如果起始材料细胞来自具有高频率编码特异结合对的细胞的供体，如具有免疫性或者免疫后的供体。由此，关联对文库不需要与组合文库具有相同的大小具有IO4到IO5个克隆的关联对文库或者具有IO2到IO3个克隆的关联对文库(克隆来自具有正在发生的相关免疫应答的供体)，对于获得代表广泛多样所需结合特异性的结合蛋白可能已经足够了。为了产生关联对文库，需要来自相同细胞的可变区编码序列的连接。目前已对两种不同的获得可变区编码序列的关联配对的方法进行了描述。细胞内PCR方法将一群细胞固定并且使其通透化，之后来自免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区编码序列在细胞内连接。这一连接可以通过重叠-延伸RT-PCR(WC) 93/03151)或者重组(Chapal, N. et al. 1997 BioTechniques 23,518-524)进行。在这些出版物中描述的扩增过程，是由下面三个或四个步骤组成的过程i)使用恒定区引物进行逆转录产生免疫球蛋白cDNA，ii)使用含有重叠-延伸设计或者重组位点的引物组对重链和轻链可变区编码序列进行PCR扩增，iii)重组连接，如果选择了该方法的话，iv)产物进行嵌套PCR产生克隆用的限制性位点。由于细胞被通透化，所以扩增产物很有可能漏到细胞之外，这样会使重链可变区和轻链可变区编码序列混杂，导致同源配对性的丧失。因此， 该步骤包含在每一次反应之后的漂洗步骤，使得这个过程耗费劳动，降低了反应的效率。更为一般地，细胞内PCR的效率极为低下，导致低的敏感性。因此细胞内PCR连接技术从未有过广泛的使用，而且原始研究实际上从未以能够被用于证实在细胞内连接的确存在的方式被可靠地重复出来。但是这对于避免重链可变区和轻链可变区编码序列的混杂以及由此引起的关联对的破坏来讲是至关重要的。在WO 01/92291中描述了不同的细胞内方法。该方法基于RNA反式拼接，在细胞内获得Vh和\编码mRNA的连接。该方法需要驱动细胞内反式拼接的DNA构建体。单细胞PCR是一种获得重链可变区和轻链可变区编码序列关联配对的不同方法 (参见例如 Coronella，J. A. et al. 2000Nucleic Acids Res. 28,E85 ；Wang, X. , et al. 2000 J. Immunol. Methods 20, 217-225) 在这些出版物中，通过使细胞的密度稀释至每个反应1 个细胞，来分散一群表达免疫球蛋白的细胞，从而避免了克隆过程中重链可变区和轻链可变区编码序列的混杂。基本上该过程被描述为由三到四个步骤组成的过程i)使用寡聚dT 引物、随机六聚引物或者恒定区引物进行逆转录产生cDNA，ii)将cDNA产物分级进入几个管，使用含有用于克隆的限制性位点的引物组对各自的可变链编码序列进行PCR扩增(在分开的管中)，iii)产物进行嵌套PCR产生用于克隆的限制性位点(可选择)以及iv)通过克隆到适宜的载体中将不同管中的重链可变区和轻链可变区编码序列连接起来，这本身是一个多步骤的过程。人类有两种类型的轻链λ和K。这表明对于每个单一细胞产生的cDNA，必须进行至少三个独立的PCR反应，之后进行分析并将适宜的片段克隆到单个载体中得到关联配对。这样所描述的单细胞PCR需要大量的操作以产生关联配对文库。尽管为了获得代表所需广泛多样结合特异性的结合蛋白，关联对文库不需要与组合文库具有相同的大小，但是用所描述的单细胞PCR方法制备一个具有如IO4到IO5个克隆的文库还是一项耗费劳动的任务。而且大量的操作大大增加了污染和人为错误的风险。为了获得与在免疫应答中通常观察到的亲和性相当的高度亲和的结合蛋白，可变区序列的关联配对与它们的扩增相联合是非常有利的。为了制备具有大量多样性的文库， 需要有一种可以适合于进行高本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．连接多个非相邻目标核苷酸序列的方法，所述的方法包含：ａ）在多重分子扩增步骤中使用来自分离的单个细胞或者等基因细胞群的模板，扩增目标核苷酸序列；以及ｂ）实现步骤ａ）中扩增出的目标核苷酸序列的连接。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M·B·奥列克西维奇，L·S·尼尔森，P·S·安德森，M·H·汉森，
申请(专利权)人：西福根有限公司，
类型：发明
国别省市：DK