一种苏云金杆菌吸附剂型与制备方法技术

本发明专利技术公开了一种苏云金杆菌吸附剂型及其制备方法。该吸附剂型以微米级的土壤矿物颗粒为载体，吸附固定有溶解处理后的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为：１∶５０－５∶１。其制备方法通过纯化提取杀虫蛋白，配制杀虫蛋白溶液，制备微米级土壤矿物颗粒，制备土壤颗粒悬浮液和进行杀虫蛋白吸附得到产品。本发明专利技术制备苏云金杆菌吸附剂型的方法简便，材料易得。所得到的吸附剂型杀虫活性高，颗粒分散好，吸附牢固，抗紫外光降解，而且使用也不会产生环境安全问题，由于商业制剂是在作物表面使用，其降解速度比在土壤内部吸附的蛋白要快，通过控制吸附制剂中杀虫蛋白的吸附量以及制剂的使用剂量，就能将其残效期控制在合理的范围。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及有害生物的生物防治
，特别是一种微生物农药苏云金杆菌吸附剂型与制备方法。
技术介绍
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种产生伴胞晶体、能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的芽胞杆菌。自1901年日本石渡报道苏云金杆菌以来，国内外科研人员对其分类、生长谢、遗传学、生态学、伴胞晶体毒素的生物化学、作用机制、基因工程菌的构建、抗虫转基因植物以及产业化等进行了广泛研究。截止目前为止已有60多个国家登记了120多个品种，其产量占生物杀虫剂总量的90％～98％，成为当前世界上产量最大、应用最广、也是最有发展前途的一种生物杀虫剂，广泛用于防治农业、林业、贮藏害虫以及医学昆虫。然而，苏云金杆菌制剂存在持效期短，防治效果易受阳光、温度、湿度、雨水等外界气候和生态条件制约等缺点。普通苏云金杆菌商业制剂含有伴胞晶体、芽胞和填料，其中伴胞晶体是主要的杀虫毒素。苏云金芽胞杆菌制剂在农作物上使用后，伴胞晶体毒素会迅速被钝化和降解，芽胞也不能在自然土壤中很好地生存。据国外研究，ThuricideA制剂在室内施用8天或14天后，毒力分别减少为最初的1/14和1/71，野外试验残效期一般为5-7天。苏云金杆菌田间应用残效期短，已成为制约该杀虫剂发展的瓶颈，如何提高其杀虫效果是苏云金杆菌科研单位和生产企业所共同面临的难题。目前延长残效期的方法主要有添加紫外线吸收剂、制备微胶囊、与化学农药复配。这些方法具有一定的实际效果，但尚未成为一种经济、环保、高效兼顾的理想手段。苏云金杆菌毒素是否会在环境中积累与以下三种因素有关(1)使用的浓度；(2)昆虫消耗的速度；(3)紫外光及土壤、作物表面微生物群对其钝化和降解的速度。自1987年首例转苏云金杆菌晶体蛋白基因抗虫植物田间试验获得成功后，抗虫转基因棉花、马铃薯、玉米、水稻、烟草、番茄等50余种作物先后进入商品化生产。转Bt基因植物在生长期内持续不断的向环境释放杀虫毒素，而当作物成熟后往往只收获其有经济价值的部分，大部分含有毒素的秸杆丢弃到田间。因此，转基因作物产生的毒素往往比苏云金杆菌商业制剂在土壤中的浓度更高，作用更持久。研究发现，转基因作物释放的毒素一旦被环境中的土壤颗粒所吸附，就会对微生物分解产生抗性，被吸附蛋白的杀虫活性可持续存在180天或234天。红外光谱和X-射线衍射分析表明，吸附后毒素蛋白的结构仅有微小变化，且具有良好的抗微生物降解性能和杀虫活性。因此，杀虫毒素被土壤矿物吸附后残效期得以延长的实验证据，为苏云金杆菌长效制剂的研究开辟了新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有微生物农药苏云金杆菌剂型所存在的缺陷，而提供一种苏云金杆菌吸附剂型与制备方法。该方法将苏云金杆菌杀虫蛋白提取、纯化后溶解于碱性溶液中，再加入土壤矿物微粒将杀虫蛋白吸附固定，从而得到性能稳定、杀虫活性高的苏云金杆菌吸附剂型。为实现本专利技术的目的，本专利技术公开了一种苏云金杆菌吸附剂型。其特征在于所说的吸附剂型以微米级的土壤矿物颗粒为载体，载体上吸附固定有溶解处理后的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为1∶50-5∶1。本专利技术还公开了这种苏云金杆菌吸附剂型的制备方法，其特征在于按照下列步骤操作(1)将苏云金芽胞杆菌原粉用NaCl溶液和无菌去离子水分别洗涤后，用pH11-12的NaOH溶液提取4-5小时，离心去沉淀后得到杀虫蛋白碱溶液，乙酸沉淀。将杀虫蛋白溶解在pH为9-11的碱溶液中，配置成浓度0.05％-0.25％(W/V)的碱溶液。(2)制备微米级土壤矿物颗粒将经过研磨并过100目筛的干燥土壤加去离子水配成含固量1.0％-10.0％(W/V)的悬浮液，充分搅拌后沉降，然后取出沉降后的上层悬浮液，重复进行上述操作，直至沉降后上层悬液澄清。收集取出的上层悬浮液，用0.5mol/L氯化钙絮凝，再收集沉淀，烘干后研碎，得到在水中分散颗粒＜2微米的颗粒；(3)制备土壤颗粒悬浮液取微米级土壤矿物颗粒用水配置成1.0％-10.0％(W/V)的悬浮液；(4)杀虫蛋白在土壤颗粒上吸附处理按杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比1∶50-5∶1的比例，在温度-10℃-50℃，摇床振摇条件下吸附0.5-10小时；(5)吸附完成后离心脱出上清液，即为土壤矿物颗粒吸附剂型，冷冻保存。本专利技术制备苏云金杆菌吸附剂型的方法简便，材料易得。所得到的吸附剂型具有以下特点(1)杀虫活性高。效价20000IU/mg的苏云金杆菌可湿性粉剂对棉铃虫三龄幼虫的半数致死浓度(LC50)为38.77μg/ml，而土壤胶粒吸附剂型的LC50在1.02～3.36μg/ml(以被吸附的杀虫蛋白计，以下同)，后者的杀虫活性比前者提高11～38倍。与未被吸附的纯杀虫蛋白(LC50为10μg/ml)相比，土壤胶粒吸附剂型的杀虫活性提高3～10倍；(2)颗粒分散好。土壤胶粒吸附杀虫蛋白前后胶粒粒径没有明显变化，且在水中分散性能良好；(3)吸附牢固。被土壤胶粒吸附的杀虫蛋白不容易被水和碳酸盐缓冲液解吸掉。去离子水连续解吸三次，总解吸率为24.66％～40.54％；碳酸盐缓冲液连续解吸三次，总解吸率为15.37％～38.81％；(4)抗紫外光降解。经紫外光照射1小时，苏云金杆菌原粉杀虫活性下降21.55％，未被吸附的纯毒素下降23.66％，而膨润土吸附剂型仅下降8.11％，红壤胶体吸附剂型下降14.07％。此外，这种制剂被土壤吸附的杀虫蛋白不仅作用时间延长，杀虫活性提高，而且使用也不会产生环境安全问题，由于商业制剂是在作物表面使用，其降解速度比在土壤内部吸附的蛋白要快，通过控制吸附制剂中杀虫蛋白的吸附量以及制剂的使用剂量，就能将其残效期控制在合理的范围。具体实施方式本专利技术的一种苏云金杆菌吸附剂型，以微米级的土壤矿物颗粒为载体，载体上吸附固定有溶解状态的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为1∶50-5∶1。上述的土壤矿物可以是南方的红壤、赤红壤、砖红壤、黄壤、黄棕壤，北方的棕壤、寒棕壤、棕钙土、暗棕壤、褐土、黑钙土，西部的黑垆土和高山草甸土，以及膨润土、高岭土中的一种或两种或两种以上的混合物。本专利技术一种苏云金杆菌吸附剂可以通过以下方法制备(1)苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的制备取苏云金芽胞杆菌原粉用0.5mol/L NaCl洗涤三次，再用无菌去离子水洗涤三次，10000r/min离心10min去上清液。将沉淀配成1％-5％(W/V)的水悬液，用0.5-1mol/L NaOH调pH11-12，4-5小时后离心去沉淀，清液以25％乙酸调pH4.4，15000r/min离心10min得杀虫活性蛋白沉淀。(2)苏云金杆菌杀虫蛋白溶液的制备将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白溶解于碱溶液，碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、Huber缓冲液(0.1mol/LNa2CO3-HCl，含25mmol/L二硫苏糖醇，pH9.5)，但最好采用碳酸盐缓冲液(由碳酸盐和碳酸氢盐组成)。碱液pH值在9-11之间，最好在9.5-10.5之间。不溶成分采用离心法去除，碱液中杀虫蛋白浓度在0.05％-0.25％(W/V)之间，浓度值采用紫外分光光度法测定。(3)微米级土壤矿物颗粒的制备取土壤样品如南方的红壤、赤红壤、砖红壤、黄壤、黄棕壤，北方的棕壤、寒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苏云金杆菌吸附剂型，其特征在于所说的吸附剂型以微米级的土壤矿物颗粒为载体，载体上吸附固定有溶解处理后的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为：１∶５０－５∶１。

【技术特征摘要】
1一种苏云金杆菌吸附剂型，其特征在于所说的吸附剂型以微米级的土壤矿物颗粒为载体，载体上吸附固定有溶解处理后的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为1∶50-5∶1。2按照权利要求1所述的方法，其特征在于所说的土壤矿物是南方的红壤、赤红壤、砖红壤、黄壤、黄棕壤，北方的棕壤、寒棕壤、棕钙土、暗棕壤、褐土、黑钙土，西部的黑垆土和高山草甸土，以及膨润土、高岭土中的一种或两种或两种以上的混合物。3一种权利要求1所述的苏云金杆菌吸附剂型的制备方法，其特征在于按照下列步骤操作(1)将苏云金芽胞杆菌原粉用NaCl溶液和无菌去离子水分别洗涤后，用pH11-12的NaOH溶液提取4-5小时，离心去沉淀后得到杀虫蛋白碱溶液，乙酸沉淀；将杀虫蛋白溶解在pH为9-11的碱溶液中，配置成浓度0.05％-0.25％(W/V)的碱溶液；(2)制备微米级土壤矿物颗粒将经过研磨并过100目筛的干燥土壤加去离子水配成含固量1.0％-10.0％(W/V)的悬浮液，充分搅拌后沉降，然后取出沉降后的上层悬浮液，重复进行上述操作，直至沉降后上层悬液澄清；收集取出的上层悬浮液，用0.5mol/L氯化钙絮凝，再收集沉淀，烘干后研碎，得到在水中分散颗粒＜2微米的颗粒；(3)制备土壤颗粒悬浮液取微米级土壤矿物颗粒用水配置成1.0％-10.0％(W/V)的悬浮液；(4)杀虫蛋白在土壤颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：周学永，
申请(专利权)人：天津理工大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]