腺伴随病毒(AAV)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用制造技术

本发明专利技术提供了新的腺伴随病毒衣壳与载体的序列以及含有这些序列的宿主细胞。也描述了使用这种宿主细胞和载体产生rAAV颗粒的方法。也提供了使用本发明专利技术的载体AAV-介导的递送治疗性和免疫原性基因。

【技术实现步骤摘要】
腺伴随病毒(AAV)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用本专利技术专利申请是国际申请号为PCT/US2004/(^8817，国际申请日为2004年9月 30日，进入中国国家阶段的申请号为“200480027905. 2”，专利技术名称为“腺伴随病毒(AAV)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用”的专利技术专利申请的分案申请。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本申请包括由国家卫生研究院(NIH)的NIDDK P30 DK47757和NHLBI P01HL59407 拨款资助的工作。美国政府享有本专利技术的一定权力。
技术介绍
腺伴随病毒(AAV)是细小病毒科家族的成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4. 7千碱基(1Λ)到61Λ的单链线形DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现，AAV指定为依赖病毒属(D印endovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV 基因组在感染后位点特异性地整合进宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装进感染性病毒)。非致病性的特性、感染性的宽宿主范围(包括非分裂细胞)与潜在的位点特异性染色体整合使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。近来的研究表明AAV载体是用于基因递送的优选运载体。迄今为止，已从人或非人灵长类(NHP)分离了几种表征良好的不同AAV。已发现不同血清型的AAV表现出不同的转染效率，也表现出对不同细胞或组织的向性。然而，以前还未对这些不同血清型之间的关系进行研究。基于AAV的构建物用于递送异源分子是理想的。专利技术概述本专利技术提供AAV的系统发生相关序列的“超家族”或“进化支”。这些AAV进化支提供用于将分子靶向和/或递送至所需靶细胞或组织的AAV序列源。本专利技术一方面提供具有至少三个AAV成员的AAV进化支，这些成员是基于AAV VPl氨基酸序列对比，使用自引值为至少75% (基于至少1000次复制)的邻接启发式算法(Neighbor-Joining heuristic)与不大于0. 05的泊松校正距离测量值(Poisson correction distance measurement)确定为系统发生相关的。合适的AAV进化支由用于产生载体的AAV序列组成。本专利技术还提供以前未知的人AAV血清型，这些血清型在本文中称为克隆观.4/ hu. 14或AAV血清型9。因此，本专利技术另一方面提供一种由AAV衣壳组成的血清型9的AAV， 该衣壳在血清学上与SEQ ID NO :123的氨基酸1-736的序列的衣壳相关，在血清学上与 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7 或 AAV8 中的任一衣壳蛋白不同。用该huAAV9的衣壳构建的载体表现出的基因转移效率类似于肝脏中的AAV8、优于肌肉中的AAV并且比肺中的AAV5高200倍。此外，该新的人AAV血清型与以前所述的 AAVl到AAV8的序列同一性小于85%，并且不被任何这些AAV交叉中和。本专利技术也提供其它新的AAV序列、含有这些序列的组合物及它们的应用。有利的是，这些组合物特别适用于出于治疗或预防目的需要反复施用的AAV载体。本专利技术的这些和其它方面可通过以下专利技术详述得到明白。附图简述附图说明图1是使用带泊松校正距离测量值的邻接启发式算法构建的系统发生关系树。基于分离的AAV vpl衣壳蛋白与分组于进化支中分离的AAV确定关系。单个衣壳克隆的组基于它们共同的祖先分类在进化支中。进化支以A到F命名；亚型以进化支字母加上一个数值表示。图2A-2AE对比了本专利技术的AAV vpl衣壳蛋白的氨基酸序列(公布了各个序列的编号)与以前公布的 AAVl 、AAV2 、AAV3-3 、AAV4-4、AAV5 、AAV6 、AAV7 、AAV8与 rh. 25/42_15、29. 3/bb. 1、cy. 2、29. 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前称为 41. 10)、 rh. 25(以前称为 41. 15)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、 rh. 37、rh. 36、rh. 23、rh. 8 和 ch5 。本专利技术的序列包括 hu. 14/AAV9、hu. 17、 hu. 6、hu. 42 、hu. 38 、hu. 40 [SEQ ID NO:87]、hu.37 、rh. 40 、rh. 52 、rh. 53 、rh. 49 、rh. 51 、rh. 57 、 rh. 58、rh. 61 、rh. 50 、rh. 43 、rh.62、rh.48、4_9/rh. 54和 4-19/rh. 55、hu. 31、hu. 32、hu. 34、hu. 45 、hu. 47 、hu. 13 , hu. 28 、hu. 29 、hu. 19 、hu. 20 、hu. 21 、hu. 23. 2 、hu. 22 、 hu. 27 、hu. 4 、hu. 2 、hu. 1 , hu. 3 、hu. 25 、hu. 15 、hu. 16 、hu. 18 、hu. 7 、hu. 11 、 hu. 9 、hu. 10 、hu. 48 、hu. 44 ,hu. 46、hu.43、hu.35、hu.24、rh. 64 、hu. 41 、hu. 39 、 hu. 67、hu.66、hu. 51、hu. 52,hu.49、hu.59、hu.57、hu.58、hu. 63 、hu. 64 、hu. 60 、 hu.61、hu. 53、hu. 55、hu. 54[SEQ ID NO:88],hu. 6 与rh. 56 。这些衣壳序列也见引为参考的序列表中。图3A-3CN对比了本专利技术的AAV vpl衣壳蛋白的核酸序列(公布了各个序列的编号)与以前公布的 AAV5(SEQ ID NO 199)、AAV3-3 (SEQ ID NO :200)、AAV4-4 (SEQ ID NO: 201)、AAVl (SEQ ID NO :202)、AAV6 (SEQ ID NO :203)、AAV2 (SEQ ID NO :211)、AAV7 (SEQID NO 213)与 AAV8(SEQ ID NO :214)、rh. 25/42_15、29· 3/bb. 1、cy. 2、29· 5/bb. 2、rh. 32、 rh. 33、rh. 34、rh. 10、rh. 24、rhl4、rh. 16、rh. 17、rh. 12、rh. 18、rh. 21 (以前称为 41. 10)、 rh. 25(以前称为 41. 15 ；GenBank 登录号 AY530557)、rh2、rh. 31、cy. 3、cy. 5、rh. 13、cy. 4、 cy. 6、rh. 22、rh. 19、rh. 35、rh. 36、rh. 37、rh. 23、rh. 8 与 ch. 5。本专利技术的核酸序列包括 hu. 14/AAV9 (SEQ ID NO: 3)、LG-4/rh.本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种腺伴随病毒（ＡＡＶ），其包含ｐｉ．２ＡＡＶ衣壳，所述ＡＡＶ　ｐｉ．２衣壳与ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：９５的２０３－７３１位所示的氨基酸序列具有至少９５％的同一性，其中所述ＡＡＶ还包含具有ＡＡＶ末端反向重复和操作性连接于调节序列的异源基因的小基因，所述调节序列引导所述异源基因在宿主细胞中表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·威尔森，G·高，M·R·阿尔维拉，L·H·范登伯格，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州立大学托管会，
类型：发明
国别省市：US