格尔德霉素在制备新型广谱抗病毒药物中的用途制造技术

格尔德霉素的新型广谱抗病毒应用，其中在体外对多种病毒复制有抑制作用，体内对疱疹病毒感染不同模型有治疗效果。体内实验格尔德霉素对单纯疱疹病毒１型及２型感染的小鼠脑炎，单纯疱疹病毒１型感染的兔角膜炎及单纯疱疹病毒１型感染的豚鼠皮肤模型均有确切治疗活性。其Ａｍｅｓ试验阴性。格尔德霉素作用于病毒复制早期，不影响单纯疱疹病毒１型的吸附释放，亦无直接灭活病毒作用。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于格尔德霉素(Geldanamycin)的医疗新用途。格尔德霉素为美国学者1970年发表的放线菌产生的抗蠕虫抗生素，于1971年及1978年分别申请专利，专利号为3595956及4075339。本专利技术中，由专利技术者于云南省土壤中分离到格尔德霉素产生菌(放线菌17997)，并发现其有广谱抗病毒活性，且目前未见有格尔德霉素抗病毒研究的报导。本专利技术证实格尔德霉素在体外对多种DNA及RNA病毒复制有抑制作用，体内对疱疹病毒感染不同模型有确切治疗效果。目前，临床应用的抗病毒药物绝大多数为核苷衍生物，为病毒DNA聚合酶或逆转录酶抑制剂，且为窄谱，格尔德霉素为非核苷类，广谱，非病毒酶抑制剂，经进一步的研究开发可成为抗病毒药物，治疗各种疱疹病毒感染及其它DNA病毒及RNA病毒所致的人类疾病。放线菌17997属于链霉菌的吸水类群，黑漆链霉菌，S.atrolaccus Yen 1957。其形态特征包括基丝不断裂，只有气丝形成孢子链，孢子丝呈紧密螺旋形，不形成菌核和分子孢子器，孢子表面光滑。培养特征包括孢子成熟后，孢子丝自溶使菌落表面形成黑色粘性湿斑(吸水现象)。 生理特征包括1、碳源利用在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、麦芽糖和肌醇等碳源的培养基生长良好。2、其它生理特征纤维素不利用，牛奶胨化，硝酸盐还原阴性。细胞壁化学特征包括含LL-DAP属细胞壁I型，糖型C，不含特征性糖。从17997菌号的发酵液中提取分离出单一有效组份，进行了理化性质测定，经鉴别与格尔德霉素相同。I提取，分离方法1.发酵液过滤后滤液上X5大孔吸附树脂柱，吸附完毕水冲后，用80％丙酮洗下有效部分，除去丙酮有黄色沉淀为粗品。2.上述粗品，再用大孔吸附柱进行第二次层析，用80％丙酮洗下有效部分，纯度在90％以上，放在冰箱中析出黄色针状结晶，纯度达95％以上。II.17997活性组份理化性质的测定及鉴别对活性组份进行稳定性、熔点、溶解度，元素分析，UV、IR、MS及1HNMR及13CNMR及DEPT谱等波谱的测定，并进行了文献资料的检索，发现它与苯安沙霉素类中的格尔德霉素相同。将两者的性质列表比较于下表表A 根据上述数据，我们推断活性组分17997应有与格尔德霉素相同的结构。本专利技术所提供的格尔德霉素的新型广谱抗病毒应用中对格尔德霉素产生菌的分类进行了鉴定；对格尔德霉素的化学提取及结构进行了研究；对格尔德霉素体内外抗病毒活性的测定，包括①格尔德霉素在细胞培养内抗病毒IC50的测定，②格尔德霉素在不同细胞培养内抗人免疫缺陷病毒1型(H1V-1)的IC50及与AZT的协同作用，③格尔德霉素在细胞内与无环乌苷(ACV-抗疱疹病毒首选药)抗HSV-1活性的比较，④格尔德霉素对不同细胞的毒性及对VERO细胞DNA、RNA、蛋白质合成的影响，⑤格尔德霉素对HSV-1小鼠脑炎的治疗作用，⑥格尔德霉素对HSV-2小鼠脑炎的治疗作用，⑦格尔德霉素对HSV-1兔角膜炎的治疗作用，⑧格尔德霉素对HSV-1感染豚鼠皮肤病损的治疗作用，⑨格尔德霉素的Ames试验。对格尔德霉素抗病毒作用机制进行了初步研究。实验结果证实格尔德霉素(17997)对HSV-1无直接灭活作用，不影响HSV-1的吸附，感染前12小时或4小时加药无抑制HSV-1活性，感染后3小时给药有抑制HSV-1活性，感染后6小时加药抗HSV-1活性丧失，说明格尔德霉素(17997)作用于HSV-1复制早期，抑制HSV-1DNA合成，格尔德霉素(17997)对HSV-1释放亦无影响，格尔德霉素(17977)对HIV-1逆转录酶及鸭肝炎病毒复制复合体DNA聚合酶均无抑制作用。下面通过表1-14及附附图说明图1、附图2和附图3对本专利技术的实验结果予以说明图1为17997、ACV及生理盐水组兔角膜平均病变曲线。图2为17997、ACV及生理盐水组兔角膜病毒分离滴度-时间曲线。图3为17997治疗HSV-1豚鼠皮损效果(箭头表示给药tid)。表1 17997在细胞培养内抗病毒活性*IC50μM/L病毒+细胞培养 细胞病变法 蚀班法单纯疱疹病毒1型 VERO 0.62±0.39 0.052±0.02单纯疱疹病毒1型 VERO 4.00±1.80 0.024水疱性口炎病毒 VERO 0.84±0.74 0.38柯萨奇病毒B3VERO1.36 1.13±0.59人免疫缺陷病毒1型 C81660.036(P24)**H90.048(P24)**柯萨奇病毒B6VERO -流感病毒甲型MDCK -流感病毒乙型MDCK -*IC50＝抑制50％细胞病变或蚀班形式的药物浓度+下列英文名称为习用的细胞株名称**对人免疫缺陷病毒1型，用测定病毒核抗原-P24方法表217997在细胞培养内抗病毒活性*TD50μM/L病毒 细胞培养实验方法 MTT法 IC50μM/L TD50/IC50单纯疱疹病毒1型VERO 蚀班法 182 0.052 3500单纯疱疹病毒2型VERO 蚀班法 182 0.024 7583人免疫缺陷病毒1型 C8166 P2440#0.036 1111H9P243.2#0.048 66.7水疱性口炎病毒 VERO 蚀班法 182 0.38 479柯萨奇病毒B3VERO 蚀班法 182 1.13 161*TD50-对50％细胞有毒性的药物浓度，MTT＝四甲基偶氮唑盐#对人免疫缺陷病毒1型，用3H胸苷掺入法表3 17997在不同细胞培养内抗人免疫缺陷病毒1型的作用细胞病毒株△实验方法IC50μM IC50μM 治疗指数C8166IIIB P240.03640 1111H9 IIIB P240.0483.2 66.7☆H9 IIIB P240.15 0.71 4.7PBMC 018a P240.0180.0181PBMC+018CP240.0220.0180.83△测定病毒核抗原-P24☆此H9为病毒慢性感染细胞株+018C为AZT耐药病毒株表4 细胞培养内17997与叠氮胸苷(AZT)的协同抗人免疫缺陷病毒1型作用药物 细胞病毒实验方法 17997 IC50μMA27 治疗指数17997 PBMC018a P24 0.046 0.69AZTPBMC018a P24 0.0045 0.5517997+AZT PBMC018a P24 0.035 0.00056 1.1有协同作用 (个1.3倍) (个80倍)由表3、表4结果可看到，17997在细胞培养内对H1V-1敏感株(018a)或AZT(抗艾滋病首选药)耐药株(018C)均有抑制活性，且17997与AZT有协同作用。表5 在细胞培养内比较17997与阿昔洛韦(ACV)抗单纯疱疹病毒1型活性药物 细胞培养 实验方法 IC50μM/L*治疗指数 备注17997 VERO蚀班法 0.052 3500ACV VERO蚀班法 8.48 ＞519ACV VERO蚀班法 0.089-6.7文献*治疗指数＝TD50/IC50表6 17997对不同细胞株的毒性细胞株 实验方法 TD50μM/L(48小时)VERO细本文档来自技高网...

【技术保护点】
格尔德霉素的新型广谱抗病毒应用，其中在体外对多种ＤＮＡ及ＲＮＡ病毒复制有抑制作用，体内对疱疹病毒感染不同模型有治疗效果，体内实验格尔德霉素对单纯疱疹病毒１型及２型感染的小鼠脑炎，单纯疱疹病毒１型感染的兔角膜炎及单纯疱疹病毒１型感染的豚鼠皮肤模型均有确切治疗活性，其Ａｍｅｓ试验阴性，格尔德霉素作用于病毒复制早期，不影响单纯疱疹病毒１型的吸附、释放，亦无直接灭活病毒作用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陶佩珍，娄志贤，姚天爵，张兴权，线素文，姚恩泰，刘玉珍，王淑琴，
申请(专利权)人：陶佩珍，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]