成骨生长肽药物组合物及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种含成骨生长肽（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＯＧＰ）的药物组合物。本发明专利技术的ＯＧＰ是人工合成的，与血清中天然存在的ＯＧＰ结构一致，该药物组合物具有促进成骨细胞、成纤维细胞增殖，促进机体成骨作用和提高骨小梁的密度，防止骨量丢失作用。在骨质疏松症的预防和治疗及骨折的治疗有广阔的应用前景。本发明专利技术提供了制备方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物制剂，具体涉及一种含成骨生长肽的药物组合物及制备方法和应用。成骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide)是近几年来在人和动物体内发现的一种能够促进骨细胞生长的14-氨基酸多肽，当机体骨折或骨髓损伤后，除了在骨折或受损骨髓的局部有成骨反应外，还伴有全身的成骨反应.经深入的实验研究表明，愈合的骨髓组织能释放几种促进成骨因子进入血循环而致全身成骨反应增强，经研究证实并分离、提纯，有一种因子为成骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide，OGP)。进一步的研究表明，OGP的氨基酸序列为ALKRQRGTLYGFGG，此序列在小鼠和人类是完全一致的，而且其作用特性也相同。有关体外实验研究显示，人工合成的OGP(与血清中天然存在的OGP结构相一致)作用于成骨细胞系的ROS、MC3T3、E1和NH3T3成纤维细胞，具有促进成骨细胞和成纤维细胞增殖、碱性磷酸酶活性增高的作用。另外还发现当血清中OGP浓度超过某一临界点以后，其作用反而转为抑制，也就是说OGP的作用呈显双向表现。有关体内实验报道和我们预实验研究显示，人工合成的OGP注人大鼠体内可促进成骨细胞增殖，促进机体成骨作用，提高骨小梁密度。本专利技术的目的是提供具有下列结构通式的OGP多肽或其医药上可接受的盐的药物组合物R1-Ala-Leu-Lys-Arg-Glu-Arg-Gly-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-R2其中R1代表选自CH3COO-或NH2-末端；R2代表-NH2或-OH末端。其中所说的药物组合物是以OGP多肽作为活性成份与药用载体组成的，并且可以含OGP为0.01～99.99％与含药用载体为99.99％～0.01％的任意比例配成100％的组成。可使用常规肽化学合成技术，以固相法或液相方法合成本专利技术的OGP的药物组合物中主要成分OGP，但较好是使用固相合成方法(例如参见Birr，C.，Aspect of the Merrifield Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg，1978；Stewart et al.，Solid Phase PeptideSynthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.Co.，Rockford，IL，1984；Barany，G.and Merrifield R.B.in The Peptides，Vol.2；Gross，E.& Meienhoffer J.，eds.，Academic Press，New York，pp3-284，1979)。也可以重组DNA技术制得。本专利技术的另一目的是提供了上述成骨生长肽(OGP多肽)的制备方法，该方法按照已设计好的和给定的氨基酸序列，利用适当的活化剂和缩合剂将经适当保护基团保护的肽链C末端氨基酸残基连接到固相载体上。其中所述的固相载体为二乙烯苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺树脂、Kiseseguhr聚酰胺、控制孔径的玻璃纤维或小珠、纤维素、聚丙烯膜和丙烯酸包被的聚苯乙烯载体。优选的固相载体包括二乙烯苯交联的聚丙烯树脂、氯甲基树脂、羟甲基树脂、对位乙酰甲基树脂、二苯甲胺(BHA)树脂、4-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂、4-(2′，-4′-二甲氧基苯基氨甲基)-苯氧基甲基树脂、2，4-二甲氧基苯甲氨胺树脂及(2，4-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰-MBHA树脂(即Rink Amide MBHA树脂)。优选的α-氨基酸的保护基团是9-芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护基团。当使用Fmoc系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基Fmoc-Leu，Fmoc-Thr(But)，Fmoc-Gly，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln，Fmoc-Tyr(But)和Fmoc-Arg(PMC)。当使用Boc系统进行固相合成时，可选用下列被保护的氨基酸残基Boc-Lys(ClZ)，Boc-Thr(Bzl)，B0c-Leu，Boc-Gly，Boc-Arg(Tos)，Boc-Gln，Boc-Tyr(Brz)。可使用肽化学合成领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)进行直接偶联，或通过活性酯例如五氟苯酯，或使用Fmoc-氨基酸-羧酸酐。可以使用羟基苯骈三氮唑(HOBt)或7-氮杂羟基苯骈三唑(HOAt)或用2-(1H-苯骈三唑-1-基)，1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)活化氨基酸。可以用手工方法或合成仪完成上述人降钙素类似物多肽的合成，但为方便起见，最好使用可从市场上购得的多肽自动合成仪，例如由Applied Biosystems公司生产的ABI 430A型或ABI 431A型肽。在Fmoc合成系统中，首先将C端第一个氨基酸(C端Fmoc-Pro)装在含羟基树脂的反应器中，按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。其中用Fmoc保护各种氨基酸的α-氨基。各氨基酸的侧链保护基分别为Thr用叔丁基(But)保护；Arg用Mtr保护；Lys用Boc保护；Tyr用But保护。使用HOBT和DCC活化各氨基酸的羧端，并完成氨基酸分子间的缩合。合成完成后，用含有或不含还原剂(如巯基乙醇)的三氟乙酸水溶液将合成的OGP肽从树脂上切割下来并去除各保护基。可用过滤法或乙醚沉淀法分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤或反相高压液相层析法纯化所需的肽。在Boc保护系统的固相合成中，典型的是使用PAM树脂。不同的是用Boc保护各种氨基酸α-氨基。氨基酸侧链保护基团分别是Lys用氯苄氧羰(CL-Z)保护ε-氨基；Arg用甲苯磺酰基(Tos)保护，Thr用苄基(Bzl)保护侧链羟基；Tyr用BrZ保护。在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团(Boc)并用二异丙基乙胺(DIEA)/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲酚(5-10％)的氟化氢(HF)，在0℃下处理1-2小时，将肽链从树脂上切下，同时除去所有保护基团。以10％-50％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，并进行多肽的氧化。冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相色谱C8柱纯化，得到HPLC纯的OGP多肽。可用已知方法将按上述方法或以重组DNA技术制得的OGP肽制成其医药上可接受的盐，特别是碱加成盐。例如，可按本领域技术人员熟知的方法，用适当的碱处理这些肽，制得酸性氨基酸的碱加成盐。可按制药领域已知的常规方法，将本专利技术的OGP制成适合临床上特定给药方式的药物组合物。例如可在本专利技术的降钙素类似物中加入适当的载体或稀释剂，如水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液以制成可经胃肠道以外途径给药的溶液剂、注射剂、乳剂、滴鼻剂、滴眼剂。也可加入淀粉、乳糖、滑石粉、蔗糖、葡萄糖或甘油、液体石蜡、脂质体或明胶等赋形剂或载体，将本专利技术的OGP制成可经胃肠道途径给药的栓剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂或脂质体包裹剂。这些制剂中除含有活性成分和适当的载体或赋形剂外，还可根据需要添加其他一些辅助成分，例如一种或多种稀释剂、填充剂、乳化剂、防腐剂、表面活性剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含成骨生长肽（ＯＧＰ）的药物组合物，其特征在于其中所说的药物组合物是以ＯＧＰ多肽作为活性成份与药用载体组成的，并且可以含ＯＧＰ为０．０１～９９．９９％与含药用载体为９９．９９％～０．０１％的任意比例配比１００％的组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈统一，俞超，施德源，崔大敷，姜晓幸，李默漪，费琴明，周国明，陈中伟，
申请(专利权)人：上海益众生物技术有限公司，中国科学院上海生物化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]