生物杀蚊剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物杀蚊剂的制备方法，该方法将两类或两类以上的杀蚊细菌发酵后产生的多种杀蚊毒素，经选择性的混合非毒性的化学添加物与物理载体制成粉末、液体、片剂、悬浮剂等多种剂型。该生物杀蚊剂能够延缓双翅目昆虫对蚊幼细菌杀蚊毒素的抗性、扩大对双翅目昆虫的杀虫谱、适合多种生态环境，同时改善杀蚊剂的有效性与稳定性。采用该生物杀蚊剂的制备方法生产的杀蚊剂对环境友好，对靶标高度专一，对人、畜及其它昆虫安全，该制剂无味，性能稳定，使用方便且价格低廉。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物灭幼蚊制剂的制备方法。技术背景蚊虫是重要卫生害虫之一，也是最重要的媒介昆虫。它可以传播多种动物 和人类疾病，包括痢疾、黄热病、西尼罗河病毒、病毒性脑炎、登革热、淋巴丝虫病，等等。据世界卫生组织(1999)估计世界上大约有二十亿人仍生活在 这些传播疾病广为发生的地区。因此，我们需要新的药物与策略来控制这些疾 病的传播。被认为是具有潜力的策略主要有注射疫苗和使传播性下降的转基因 蚊子等，但在目前，将主要依赖于化学杀虫剂。自从第二次世界大战以来，传 播性疾病控制的方法主要依靠使用广谱的化学合成杀虫剂来减少媒介蚊虫的数 量，然而，由于化学合成的杀虫剂能使蚊子产生抗性；此外化学杀虫剂容易对 环境造成污染，对水源与食物的污染会造成一些非标靶昆虫和一些脊椎动物的 死亡，因此在很多国家化学合成杀虫剂已被限制使用。世界卫生组织(1999)致力于用徼生物杀蚊剂来代替化学杀蚊剂，用微生物控制媒介昆虫主要是通过控制蚊子的幼虫来实现，苏云金芽孢杆菌以色列亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis(Bti))和球形芽孢杆菌 (Bacillus sphaericus (Bs))是用得最广的杀蚊细菌。苏云金芽孢杆菌以色列 亚种和球形芽孢杆菌是能运动的革兰氏阳性细菌，呈短杆状、能够在大自然中 分离得到，它们在孢子形成时产生伴孢晶体，该晶体在昆虫体内消化后对昆虫 具有致死作用。在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中，关键的杀蚊蛋白有CytlA(27 kDa), CryllA(72 kDa) ， Cry4A(128 kDa)和Cry4B(134 kDa);在球形芽孢杆菌 中，杀蚊蛋白是Bin双元毒蛋白，它由两种蛋白质组成， 一个是51.4kDa毒蛋 白结构域和一个41.9 kDa毒蛋白结构域，它们共结晶成一个小的类芽孢体。相 比于化学杀蚊剂，生物杀蚊剂灭杀蚊子更专一且有效，而且本身也能够被大自 然降解，因此不会造成环境污染。在发达国家，这些菌株制成的杀蚊剂型已成 功地用于控制蚊幼的产生。由杀蚊细菌制成的杀蚊剂在发达国家取得了一定的市场，但高昂的价格阻 止了它们在发展中国家的使用，如中国、亚洲、非洲。而且，对于这些产品的 广泛使用产生的抗性也引起了人们的关注，已经有好几个国家报道了球形芽孢 杆菌在田间使用对库蚊属蚊幼的虫口数量的影响。抗性定义为在一段时间内对 昆虫重复使用杀虫剂而造成的昆虫对杀虫剂敏感性差异，这种差异可以通过统 计软件计算LDs。或LDs5来实现。潜在的抗性问题使我们在使用单一的杀蚊毒素时 存在缺陷。由于苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌中的杀蚊毒素在生 物化学与毒理学上的存在着明显差异，因此组合使用这两类菌株，或经重组工程菌产生此两类菌株中的毒素都能够有效的增强蚊幼对生物杀蚊剂的抗性，如 通过混合球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的CytlA蛋白或者是直 接混合苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌能够显著地改善蚊幼致乏库 蚊对杀蚊细菌球形芽孢杆菌的抗性，这种通过组合来改善蚊幼对杀蚊毒素的抗 性在商业上是值得提倡的，但在此方面商业上的应用还较少。近来，在杀蚊剂的研究中，重点放在对高杀蛟活性菌株的分离、改进和对 制剂技术改善上。例如，美国专利U.S. Pat. Nos. 5, 275, 815和5, 847， 079通 过分离方法得到了一种新颖的杀蚊细菌苏云金芽孢杆菌； U. S. Pat. No. 4， 865， 842专利技术了多种缓释剂应用于杀蚊剂中；U. S. Pat. No. 4,166,112公布了用Bacillus ONR-60A的芽孢来控制蚊幼的方法； U. S. Pat. No. 5, 912,162公布了一种能够大量产生杀蚊毒素的发酵培养基。在中 国ZL 03113555.2的专利灭蚊制剂的制备方法及灭蚊制剂的应用公开了一 种采用苏云金芽孢杆菌以色列变种制备摇蚊幼虫杀灭制剂的制备与应用方法， 对发酵液进行后处理得到液剂、粉剂或固定剂型的制剂，此种制剂对花翅摇蚊 具有特殊高效，使用浓度内24小时对3龄幼虫的杀灭率达到98%。包含有杀蚊细菌的发酵产物、或者是它的芽孢、或是分离得到的毒素的生 物杀蚊剂。必须在施用地有稳定的货架寿命。要达到这种目的，专利技术的剂型中 必须包含有防止活性物质免受化学因素、生物因素、物理因素和自然条件(如 阳光等)降解的物质。因此，为了得到有效的杀蚊活性，专利技术能使活性成分在 应用地域高性能的分散剂型是必要的。考虑到在蚊幼生命周期中，蚊的卵必须产在静止的水面上，随后幼虫孵化 进入池塘、死水和有水的地方。因此专利技术一种能够抵抗水与阳光，同时能够漂 浮于施用水面上，并且易于分散并保持较长的生物活性的剂型在杀蚊幼应用上 是有效的。此外干粉剂型也是一个较好的选择，它易于包装、贮藏和运输到蚊 幼繁殖的地域使用。因此，有必要制成这样的生物剂型，有适合的载体，在应 用地域能长时间的喷施而能够有效的控制蚊幼，并且，对环境是友善的。这样 的剂型具有实践、经济、有效、并且在生态上是安全的。
技术实现思路
本专利技术正是为了满足上述技术要求而专利技术的一种通过组合使用多个菌株来 改善杀蚊幼活性，扩大杀蛟谱与减少对靶标蚊幼的抗性的生物杀蚊剂的制备方 法。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是一、 生物杀蚊剂液体制剂的制备方法按以下工艺方法制成① 将真空冷冻干燥保存的菌种分别接种到生长液体培养基上，在33'C,搅 拌速度200rpm条件下，活化培养16小时；② 取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在33'C下静止培 养24小时；③ 将经鉴定的单菌落分别接种到500ml液体生长液体培养基上，在33'C， 搅拌速度200rpm条件下，摇瓶培养12小时； 种子罐发酵将上述培养好的摇瓶菌种在无菌条件下按1%的接种量引入到装有发酵培养基的种子发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33士rC;罐压保持在0. 3-0. 5kg/cm2;溶氧每分钟1: 1; pH保持在7. 8-8. 2;搅拌速度 190-210rpm;发酵时间为7小时； 发酵罐发酵将上述在种子罐培养好的种子液按1%的接种量引入到装有 发酵培养基的发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33土1'C;罐压保持在0. 3-0. 5kg/cm2;溶氧每分钟1: 1; pH保持在7.8-8.2;搅拌速度190-210rpm; 发酵时间为36小时左右，当菌体产生的孢子形成率达85%以上时即可放罐； 采用超滤膜过滤的方法浓縮；⑦依次加入重量比均为0.1%-10%的防腐剂、诱蚊剂、分散剂，防腐剂的成 分为苯甲酸钠，诱饵剂的成分为复合维生素B与蜂蜜(重量比为2:1)的混合物， 分散剂的成分为甲基纤维素；混匀后，即为液体制剂。二、 生物杀蚊剂粉末制剂的制备方法按以下工艺方法制成首先按上述生物杀蚊剂液体制剂的制备方法进行完第①、②、③、④、 和⑥步后，继续进行如下工艺方法⑦依次加入重量比为0.1%-10%的诱饵剂、0. 1%-10%的干燥剂；干燥后加入 重量比为0. 1%-10%的分散剂、0. 1%-10%的缓释剂，经干燥混匀后；再与重量比 为0. 1%-10%的防晒剂、0.1%-10%的粘湿剂一起混匀。诱饵剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物杀蚊剂液体制剂的制备方法，其特征在于：所述生物杀蚊剂液体制剂按以下工艺方法制成：①将真空冷冻干燥保存的菌种分别接种到生长液体培养基上，在３３℃，搅拌速度２００ｒｐｍ条件下，活化培养１６小时；②取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在３３℃下静止培养２４小时；③将经鉴定的单菌落分别接种到５００ｍｌ液体生长液体培养基上，３３℃，搅拌速度２００ｒｐｍ条件下，摇瓶培养１２小时；④种子罐发酵：将上述培养好的摇瓶菌种在无菌条件下按１％的接种量引入到装有发酵培养基的种子发酵罐中，发酵时的各项参数是：发酵温度３３±１℃；罐压保持在０．３－０．５ｋｇ／ｃｍ↑［２］；溶氧每分钟１∶１；ｐＨ保持在７．８－８．２；搅拌速度１９０－２１０ｒｐｍ；发酵时间为７小时；⑤发酵罐发酵：将上述在种子罐培养好的种子液按１％的接种量引入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵时的各项参数是：发酵温度３３±１℃；罐压保持在０．３－０．５ｋｇ／ｃｍ↑［２］；溶氧每分钟１∶１；ｐＨ保持在７．８－８．２；搅拌速度１９０－２１０ｒｐｍ；发酵时间为３６小时左右，当菌体产生的孢子形成率达８５％以上时即可放罐；⑥采用超滤膜过滤的方法浓缩；⑦依次加入重量比均为０．１％－１０％的防腐剂、诱蚊剂、分散剂，防腐剂的成分为苯甲酸钠，诱饵剂的成分为复合维生素Ｂ与蜂蜜（重量比为２∶１）的混合物，分散剂的成分为甲基纤维素；混匀后，即为液体制剂。...

【技术特征摘要】
1、一种生物杀蚊剂液体制剂的制备方法，其特征在于所述生物杀蚊剂液体制剂按以下工艺方法制成①将真空冷冻干燥保存的菌种分别接种到生长液体培养基上，在33℃，搅拌速度200rpm条件下，活化培养16小时；②取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在33℃下静止培养24小时；③将经鉴定的单菌落分别接种到500ml液体生长液体培养基上，33℃，搅拌速度200rpm条件下，摇瓶培养12小时；④种子罐发酵将上述培养好的摇瓶菌种在无菌条件下按1％的接种量引入到装有发酵培养基的种子发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33±1℃；罐压保持在0.3-0.5kg/cm2；溶氧每分钟1∶1；pH保持在7.8-8.2；搅拌速度190-210rpm；发酵时间为7小时；⑤发酵罐发酵将上述在种子罐培养好的种子液按1％的接种量引入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33±1℃；罐压保持在0.3-0.5kg/cm2；溶氧每分钟1∶1；pH保持在7.8-8.2；搅拌速度190-210rpm；发酵时间为36小时左右，当菌体产生的孢子形成率达85％以上时即可放罐；⑥采用超滤膜过滤的方法浓缩；⑦依次加入重量比均为0.1％-10％的防腐剂、诱蚊剂、分散剂，防腐剂的成分为苯甲酸钠，诱饵剂的成分为复合维生素B与蜂蜜(重量比为2∶1)的混合物，分散剂的成分为甲基纤维素；混匀后，即为液体制剂。2、 一种生物杀蚊剂粉末制剂的制备方法，其特征在于所述生物杀蚊剂粉末制剂按以下工艺方法制成-① 将真空冷冻干燥保存的菌种分别接种到生长液体培养基上，在33'C，搅 拌速度200rpm条件下，活化培养16小时；② 取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在33'C下静止培 养24小时；③ 将经鉴定的单菌落分别接种到500ml液体生长液体培养基上，在33°0， 搅拌速度200rpm条件下，摇瓶培养12小时；④ 种子罐发酵将上述培养好的摇瓶菌种在无菌条件下按1%的接种量引入 到装有发酵培养基的种子发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33士rC; 罐压保持在0. 3-0. 5kg/cm2;溶氧每分钟1: 1; pH保持在7.8-8.2;搅拌速度 190-210rpm;发酵时间为7小时；⑤ 发酵罐发酵将上述在种子罐培养好的种子液按1%的接种量引入到装有 发酵培养基的发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33土1'C;罐压保持在 0. 3-0. 5kg/cm2;溶氧每分钟l: 1; pH保持在7.8-8.2;搅拌速度190-210rpm; 发酵时间为36小时左右，当菌体产生的孢子形成率达85%以上时即可放罐；◎采用超滤膜过滤的方法浓縮；⑦依次加入重量比为0.1%-10%的诱饵剂、0. 1%-10%的干燥剂；干燥后加入 重量比为0. 1%-10%的分散剂、0. 1%-10%的缓释剂，经干燥混匀后；再与重量比 为0. 1%-10%的防晒剂、0.1%-10%的粘湿剂一起混匀；诱饵剂为复合维生素B与 蜂蜜(重量比为2:1)的混合物；干燥剂的成分为硅藻土与磷酸钙(重量比为l: 1);分散剂的成分为甲基纤维素；缓释剂的成分为脂肪酸盐；防晒剂的成分为 对二甲氨基苯甲酸异辛酯；粘湿剂的成分为聚氧乙烯硬脂酸盐；混匀后，加入助剂碳酸钙，经喷雾干燥成粉末制剂。3、 一种生物杀蚊剂片剂的制备方法，其特征在于所述生物杀蚊剂片剂按 以下工艺方法制成① 将真空冷冻干燥保存的菌种分别接种到生长液体培养基上，在33'C，搅拌速度200rpm条件下，活化培养16小时；② 取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在33'C下静止培 养24小时；③ 将经鉴定的单菌落分别接种到500ml液体生长液体培养基上，在33'C, 搅拌速度200rpm条件下，摇瓶培养12小时；④ 种子罐发酵将上述培养好的摇瓶菌种在无菌条件下按1%的接种量引入 到装有发酵培养基的种子发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33士rC; 罐压保持在0. 3-0. 5kg/Cm2;溶氧每分钟1: 1; pH保持在7.8-8.2;搅拌速度 190-210rpm;发酵时间为7小时；⑤ 发酵罐发酵将上述在种子罐培养好的种子液按1%的接种量引入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵时的各项参数是发酵温度33土rc，罐压保持在0. 3-0. 5kg/cm2;溶氧每分钟l: 1; pH保持在7. 8-8. 2;搅拌速度190-210rpm; 发酵时间为36小时左右，当...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭明，廖文彬，董金琢，
申请(专利权)人：彭明，廖文彬，董金琢，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]