一种防治蔬菜真菌病害的微生物农药的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方法，属于微生物技术领域。该方法利用一种从浙江杭州临安天目山采集的土样中分离筛选出的淀粉酶产色链霉菌Ｄ，经过菌种的活化培养；发酵培养；发酵物提取；将所提纯的活性化合物配以农用药物辅料等步骤，制备成多种剂型的农用药物。该微生物农药可用于防治黄瓜枯萎病和番茄灰霉病等蔬菜真菌病害，其防治效果较常规化学药剂略优，且安全。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物
，特别是涉及生防放线菌——淀粉酶产色链霉菌D的培养及其代谢产物的分离与应用。
技术介绍
放线菌(Actinomycetes)与人类的关系极为密切。据统计，在已发现的抗生素 中，有61.7%为放线菌所产生。常用的抗生素除青霉素和头孢霉素类外，绝大多 数都是放线菌的产物。土壤是放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效 抗菌活性的放线菌产生抗生素是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不 可少的基础工作。目前对植物病害的防治，主要采用化学农药杀灭病原菌，但化学农药对人 畜的毒副作用和残留问题至今仍难以有效的解决。利用放线菌产生的抗病原真 菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、 便于生产、无毒无害等优点。本专利技术从杭州的土壤中分离到一株生防放线菌，并对此生防放线菌发酵代 谢产物中的抗菌成分进行分离，得到了主要活性成分，经四大光谱分析，明确 了其结构式。该专利技术为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株 和生物活性化合物。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提 供一种从杭州土壤中分离筛选出的放线菌-淀粉酶产色链霉菌D;本专利技术的另一 目的是提供利用该菌株通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分植物真菌病害 的微生物农药及其制备方法。本专利技术淀粉酶产色链霉菌的分离、筛选与鉴定是于2006年8月在浙江杭州临安天目山釆集的土样中，经分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为淀粉酶产色链霉菌(SfreptoA^c^ d/os似toc/^o附ogeas )， 定名为淀粉酶产色链霉菌 (S/re/ to附yces ^^totoc/zrawo^WM) D。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No. 2060。淀粉酶产色链霉菌D显微形态特征孢子丝直、钩状、松散螺旋形，孢子 长圆、椭圆或卵圆形。本专利技术所述的淀粉酶产色链霉菌D，经发酵提取可获得对部分植物 真菌病害病原菌具有抑制作用的活性化合物 [2,4-Dioxo-1-(3,4'5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1,2，3,4-tetrahydro-pyrimidin-5一yl]-methylamino-acetic acid。本专利技术目的通过以下技术方案来实现一种防治番茄灰霉病和黄瓜枯萎病等植物真菌病害微生物农药的制备方 法，按以下步骤进行(1)菌种的活化培养将分离保存的淀粉酶产色链霉菌D菌种移至试管内高氏一号斜面上，在28C土rC条件下，培养至试管斜面长满孢子；(2) 发酵培养发酵培养液为每1000mL中含有黄豆饼粉20g，玉米粉15g， 麸皮10g， NH4N033g， (NH4) 2S045g， CaC035g， MgS04lg，灭菌，待冷却至 4(TC，在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌D至发酵培养液中，在28'C士rC条 件下，培养5天；(3) 发酵物提取发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析， 分离纯化获得活性化合物[2,4-Dioxo-1-(3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1 ，2,3,4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid，该化合物分子式为 C13H1909N3，结构式见下图；(4)将此活性化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。本专利技术的有益效果一是本专利技术从杭州土壤分离筛选出代谢物产量高、并对部分植物真菌病害 病原菌具有较强抑制作用的淀粉酶产色链霉菌D，这为农业上防治植物真菌病害病原菌提供了一种微生物菌株；二是本专利技术提供了从淀粉酶产色链霉菌D的发酵物中提取其活性代谢产物 [2,4-Dioxo-1-(3，4，5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1 ，2,3,4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid,并进而帝!j备成可防治植物真菌病害的微生物源农药的制备方法；该农药应用于植物真菌病害的防治，其 效果较常规化学药剂略优(见试验例表1)，为农用杀菌剂的开发增添了新的途 径。具体实施方式实施例h (淀粉酶产色链霉菌D的分离与筛选)本专利技术于2006年8月在浙江临安天目山采集的土样中，经分离、培养、发 酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤，从中获 得淀粉酶产色链霉菌(S鄉to亭eW加tocWwogeas) D，保存。淀粉酶产色链霉菌(5^e/7to/w;^es&astotoc/ rawogees) D抑菌活性测定取 其发酵上清液lmL于无菌培养皿内，与9mL冷却至5(TC的PDA培养基迅速混 匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的黄瓜枯萎病或番茄灰霉 病等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28°C 培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径， 以下列公式计算抑制率菌丝生长抑制率:对照菌，直g;^理菌落餘x 10线对照菌落直径-4测定结果表明淀粉酶产色链霉菌(5^e/ to附yces 6 /ostotoc/zrawogew) D 代谢产物对黄瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制率分别为83.8%和78%。 实施例2:(淀粉酶产色链霉菌D发酵代谢产物的制备方法)按以下步骤进行(1)菌种试管斜面活化培养斜面培养基为高氏一号培养基，其组分与含量为K2HPO40.5g、KNO3lg、MgSO40.5g、可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、FeSO40.01g、琼脂20g，溶化后补足水至1L;在无菌条件下用接种环挑取少许淀粉酶产色链霉菌D的孢子，至已灭菌的高氏一号培养基试管(15x150mm)中，置培养箱内 28°C±1°C，活化培养96h，至试管斜面长满孢子；(2) 发酵培养发酵培养液为每1000mL中含有黄豆饼粉20g，玉米粉15g， 麸皮10g， NH4N033g， (NH4)2S045g， CaC035g, MgS04lg，余量为水；每300mL 三角瓶装40mL发酵培养液，配制后12rC灭菌20min，待冷却至40。C在无菌条 件下，挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D孢子接种，28°C±1°C，发酵培养5天；(3) 发酵物提取发酵完毕后收集发酵液，在真空条件下浓縮至浸膏，再 以异丙醇溶解，离心取上清液，浓縮至浸膏，而后上硅胶柱层析，以异丙醇和 水(体积比10%~90% )洗脱，分离纯化得活性化合物 [2，4-Dioxo-1-(3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1,2，3'4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid 。以下实施例3、 4中所述的淀粉酶产色链霉菌D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治黄瓜枯萎病和番茄灰霉病的微生物农药的制备方法，包括以下步骤：（１）菌种的活化培养：将淀粉酶产色链霉菌Ｄ菌种移至试管内高氏一号斜面上，在２８℃±１℃条件下，培养至试管斜面长满孢子，所述的淀粉酶产色链霉菌Ｄ菌种保藏登记号为ＣＧＭＣＣＮｏ．２０６０；（２）发酵培养：发酵培养液为每１０００ｍＬ中含有黄豆饼粉２０ｇ，玉米粉１５ｇ，麸皮１０ｇ，ＮＨ↓［４］ＮＯ↓［３］３ｇ，（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］５ｇ，ＣａＣＯ↓［３］５ｇ，ＭｇＳＯ↓［４］１ｇ，待冷却至４０℃，在无菌条件下接种淀粉酶产色链霉菌Ｄ至发酵培养液中；（３）发酵物提取：发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得活性化合物；此活性化合物的结构式如下：＊＊＊（４）将此化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。

【技术特征摘要】
1、一种防治黄瓜枯萎病和番茄灰霉病的微生物农药的制备方法，包括以下步骤(1)菌种的活化培养将淀粉酶产色链霉菌D菌种移至试管内高氏一号斜面上，在28℃±1℃条件下，培养至试管斜面长满孢子，所述的淀粉酶产色链霉菌D菌种保藏登记号为CGMCC No.2060；(2)发酵培养发酵培养液为每1000mL中含有黄豆饼粉20g，玉米粉15...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞晓平，申屠旭萍，王为民，董胜张，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]