本发明专利技术涉及一种溶菌酶组合抑菌剂，主要解决溶菌酶对革兰氏阴性菌抑制效果差的问题。其由溶菌酶与甘氨酸以及乙二胺四乙酸进行复配组成，各组分按质量份的配比为：溶菌酶0.25～5，甘氨酸1～10，乙二胺四乙酸0.05～0.5；其可以为固态组合物，其在含菌料中的添加量按重量比为1.3～15‰，也可以将其溶解于10mM、pH7.4的磷酸缓冲液中，再加入含菌料中使用。本发明专利技术可以使溶菌酶对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抑制效果提高40至600多倍，本发明专利技术相对于抗生素和化学防腐剂而言，具有绿色可降解、无残留和安全的特点。
Lysozyme combined bacteriostatic agent
The invention relates to a lysozyme combination bacteriostatic agent, which mainly solves the problem that the inhibition effect of lysozyme on Gram negative bacteria is poor. The lysozyme and EDTA and glycine was composed of components according to the mass ratio was 0.25 ~ 5 glycine 1 lysozyme, ~ 10, 0.05 ~ 0.5 of the EDTA; for solid composition, the bacteria in the amount of material according to the weight ratio of 1.3 to 15 per thousand, can also be phosphate buffer the liquid dissolved in 10mM and pH7.4, adding material used in bacteria. The invention can make the lysozyme inhibition effect on Escherichia coli and other gram negative bacteria increased 40 to 600 times, compared with the antibiotic and chemical preservatives, with green biodegradable, no residue and safety features.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物抑菌剂，尤其涉及针对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抑菌剂。
技术介绍
目前，在食品、饲料等领域中使用的抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的抗菌试剂主 要有抗生素和化学防腐剂两类。抗生素虽然抗菌效果良好，但过度使用会引发病原菌快速 变异和耐药性增强，导致严重的健康问题，且抗生素残留后不易被快速降解。化学防腐剂则 难以被人体分解，积累到一定量后可能具有潜在的毒副作用，因此存在安全性隐患。于是需 要寻找可替代的、安全易降解的抗菌试剂。目前已被发现的可被降解的抗菌试剂主要有溶菌酶、抗菌肽、乳铁蛋白、中草药提 取物等。其中溶菌酶是公认安全的抗菌性酶，允许在食品、医药、饲料等体系中添加使用。但 是溶菌酶虽然对部分革兰氏阳性菌有良好的杀灭效果，而对大肠杆菌等革兰氏阴性菌通常 却抑制效果很低。因为溶菌酶主要通过水解细菌细胞壁的肽聚糖层而发挥抗菌作用，革兰 氏阳性菌的肽聚糖层位于细菌细胞壁的最外侧，而革兰氏阴性菌的肽聚糖层则位于细菌细 胞壁的内侧，其外部还有细胞外膜。因此提高溶菌酶对革兰氏阴性菌抗菌性能的研究具有 积极的应用价值。
技术实现思路
申请人:针对溶菌酶对革兰氏阴性菌抑制效果低的问题进行了大量研究工作，在此 基础上提供一种溶菌酶组合抑菌剂，其可以有效提高溶菌酶对革兰氏阴性菌的抗菌性能， 例如可以有效抑制属于食品病源菌的革兰氏阴性菌一大肠杆菌。本专利技术的技术方案如下溶菌酶组合抑菌剂，由溶菌酶与甘氨酸以及乙二胺四乙酸(EDTA)进行复配组成，各组 分按质量份的配比为溶菌酶0. 25 5甘氨酸1 10乙二胺四乙酸 0.05 0.5其可以为固态组合物，其在含菌料中的添加量按重量比为1. 3 15%。。也可以将其溶解于浓度为10mM、pH 7. 4的磷酸缓冲液中，配成1. 3 15%。的质量 体积浓度后(其中各组分的质量体积浓度(g/L)为溶菌酶0.25 5;甘氨酸1 10;乙 二胺四乙酸0.05 0.5)，加入含菌料中使用。本专利技术中甘氨酸作为氨基酸，不仅与参与肽聚糖组成的关键单元丙氨酸构型相 似，还可以在细菌生长时取代丙氨酸，而且它本身还参与形成肽聚糖。另外，甘氨酸还能够 在一定程度上改变革兰氏阴性菌细胞外膜脂多糖中的内毒素的构型。这些不仅使得肽聚糖 层更加松散，而且细胞形态发生改变，细胞的通透性增加；乙二胺四乙酸(EDTA)是细菌细 胞表面二价阳离子如Mg2+和Ca2+的螯合剂。Mg2+和Ca2+可以稳定细菌细胞壁中肽聚糖、磷壁酸及脂多糖所带的负电荷，增强这些分子的交联和折叠，提高细菌细胞表面的致密性。Mg2+ 和Ca2+被螯合后，不仅减弱了细菌细胞壁的交联与折叠，而且导致细胞表面一部分脂多糖 片段溶出，形成孔洞。上述增效剂甘氨酸和EDTA都是食品添加剂目录中允许使用的物质， 上述增效剂都具有针对革兰氏阴性菌细胞外膜的穿透或渗透功能，能够促进溶菌酶穿越大 肠杆菌的细胞外膜，到达溶菌酶的水解作用位点肽聚糖层，从而提高溶菌酶对大肠杆菌的 抑菌效果。本专利技术可以使溶菌酶对大肠杆菌的抑制效果提高40多倍至600多倍。本专利技术以溶菌酶为主，将甘氨酸、EDTA与溶菌酶复配，构成溶菌酶组合抑菌剂。复 配后的组合抑菌剂随食品摄入人体后，其主体成分溶菌酶作为蛋白质可以被消化道内的蛋 白酶水解成小肽和氨基酸，从而被吸收、利用，而甘氨酸本身即为人体可以吸收和转化的营 养成分，EDTA虽不能被人体吸收利用，但作为已被批准使用的食品添加剂，可以经消化道排 出体外，并具有螯合游离二价金属离子的性能。由上述可见，本专利技术相对于抗生素和化学防 腐剂而言，具有绿色可降解、无残留和安全的特点。本专利技术抑菌剂的初始状态为固态混合物，可以直接以固态混合物加入含菌料中使 用，但通常以1. 3 15%。的质量体积浓度溶解于10mM、pH7. 4的磷酸缓冲液中以溶液状态使用。附图说明图1示出溶菌酶及溶菌酶不同组合的抑菌剂对大肠杆菌ATCC25922的抑制率比较。图2示出溶菌酶及溶菌酶不同组合的抑菌剂对大肠杆菌ATCC25922的外膜渗透性 能比较。附图3示出溶菌酶及溶菌酶不同组合的抑菌剂对大肠杆菌DH5 α的抑制率比较。 具体实施例方式试剂和菌株以下实施例中所用溶菌酶为蛋清溶菌酶，为Sigma公司产品，但也可 以用其他国产蛋清溶菌酶产品取代。甘氨酸、EDTA为国产分析纯试剂。大肠杆菌ATCC25922 和大肠杆菌DH5 α均来自于美国典型培养物保藏中心ATCC。固态溶菌酶组合抑菌剂的配制将溶菌酶、甘氨酸、EDTA按质量份配比 0. 25 5 :1 10 :0. 05 0. 5称取各组分，混合均勻即可。液态溶菌酶组合抑菌剂的配制将固态溶菌酶组合抑菌剂溶解于浓度10mM、 pH7. 4磷酸缓冲液中，使溶菌酶、甘氨酸、EDTA的浓度(质量体积)分别达到0. 25 5mg/mL、 1 10mg/mL、0. 05 0. 5 mg/mL，或配成4倍于所述浓度的浓缩液使用。下面是本专利技术的实施例。实施例1——配方1对大肠杆菌ATCC25922的抑制效果分别称取溶菌酶細g、甘氨酸16mg、EDTA 0. 8mg,混合均勻，将其溶解于4mL浓度为 IOmM, pH7. 4的磷酸缓冲液中，配成四倍浓度的溶菌酶组合抑菌剂溶液，溶液中溶菌酶、甘 氨酸、EDTA的浓度分别为lmg/mL、％ig/mL和0. ang/mL。将配成的溶菌酶组合抑菌剂溶液 200 μ L加入到200 μ L菌浓为106CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400 μ L LB培养基 中作用两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为102_°2 ；与本专利技术的对比实验单独用溶菌酶^ig溶解于4mL浓度为10mM、pH7. 4的磷酸缓冲液中，取其200 μ L加入到200 μ L菌浓 为106CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400 μ L LB培养基中作用两小时，对大肠杆菌 ATCC25922的抑菌率为10°_3，本专利技术与后者比较，抑菌率提高了 52. 5倍。上述抑菌率以NO/ N表示，其中NO表示未加入本专利技术抑菌剂溶液的样品形成的菌落数，N表示加入本专利技术抑菌 剂溶液的样品形成的菌落数，以下同此。实施例2——配方2对大肠杆菌ATCC25922的抑制效果分别称取溶菌酶40mg、甘氨酸80mg、EDTA %ig，混合均勻，将其溶解于4mL浓度为10mM、 PH7. 4的磷酸缓冲液中，配成四倍浓度的溶菌酶组合抑菌剂溶液，溶液中溶菌酶、甘氨酸、 EDTA的浓度分别为10mg/mL、20mg/mL和lmg/mL。将配成的溶菌酶组合抑菌剂溶液200 μ L 加入到200 μ L菌浓为106CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400 μ L LB培养基中作用 两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为IO3 45 ；与本专利技术的对比实验①单独用溶菌酶 40mg溶解于4mL浓度为10mM、pH7. 4的磷酸缓冲液中，溶菌酶浓度为10mg/mL，取其200 μ L 加入到200 μ L菌浓为106CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液和400 μ L LB培养基中作用 两小时，对大肠杆菌ATCC25922的抑菌率为IOl tl ；②用溶菌酶40mg、甘氨酸SOmg溶解于4mL 浓度为10本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．溶菌酶组合抑菌剂，其特征在于由溶菌酶与甘氨酸以及乙二胺四乙酸进行复配组成，各组分按质量份的配比为：溶菌酶 ０．２５～５甘氨酸 １～１０乙二胺四乙酸 ０．０５～０．５按权利要求１所述溶菌酶组合抑菌剂，特征在于其为固态组合物，其在含菌料中的添加量按重量比为１．３～１５‰。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史锋，尹金凤，李永富，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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