朝鲜蓟抗菌剂—朝鲜蓟提取物的一种新用途及其生产方法技术

本发明专利技术介绍了一种朝鲜蓟提取物作为天然抗菌剂的新用途及其生产方法。它将朝鲜蓟叶、花苞、茎干粉通过索氏提取得到的原提取液，分别进行氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的正丁醇相进行反复ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０柱层析和硅胶柱层析分离，得到四个不同组分，再分别进行高压液相制备柱分离，得到８种不同的天然抗菌化合物。本发明专利技术的朝鲜蓟各提取物及其各萃取分离成分对大部分测试菌株基本都有抑制作用，而其中以叶子提取物的抑制性最强和正丁醇萃取液的抑菌活性最强。提取物８种活性成分对被测菌株具有广泛的抗菌活性，其最低抑菌浓度在５０～２００μｇ／ｍＬ之间。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是阐述一种朝鲜蓟提取物作为天然抗菌剂的新用途及其生产方法。
技术介绍
朝鲜蓟(Cynara scolymus L.)，别名洋蓟、洋百合、法国百合、荷花百合。菊科多年生大型草本，植株高达1.5米，叶大、羽状深裂，夏季在茎顶着生直径为15厘米左右的头状花，总苞片卵形呈覆瓦状排列。花苞可食用。富含蛋白质(3.6％)、糖类(16％)、维生素A、B、C及Ca、P、Fe、Na等元素，营养很丰富。研究表明朝鲜剂叶、花苞、茎等含有多种活性成份。如咖啡酰奎宁酸类衍生物(包括绿原酸(chlorogenic acid)、菜蓟素(cynarin)、3，5二咖啡酰奎宁酸、4，5二咖啡酰奎宁酸等)和黄酮类化合物(包括木犀草素(cynaroside)、菜蓟苦素(cynaropicrin)、芹菜素(apigenin)等)。中草药药用成分研究表明，上述成分具有1)保护和恢复肝脏机能；2)降低胆固醇和血脂浓度，促进脂肪的消化；3)抗氧化、增强免疫力、延缓衰老等保健作用。然而，上述成分除具有以上活性外，还具有其它方面有价值的活性和用途，如抗菌活性等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种朝鲜蓟提取物作为天然抗菌剂的新的用途及其提取方法，可在食品保鲜和抗菌药物的开发利用方面应用。本专利技术提供了一种朝鲜蓟提取物天然抗菌活性成分的提取方法，如说明书附图所示，其包括下列步骤步骤1.索氏提取分别称取500g叶、花苞和茎干粉原料分别置于3000mL75％乙醇溶液的索氏提取器中，于沸水浴中提取，至索氏提取器内的溶液近乎无色为止。步骤2.提取液蒸发浓缩提取后的约2500mL提取液，旋转蒸发真空浓缩(40℃，0.08MPa)至约800mL浓缩液。步骤3.第一次萃取分离往浓缩后的约800mL溶液中加入400mL的氯仿液进行萃取，分层后，弃去下层的氯仿相，保留水相。步骤4.第二次萃取分离往上次萃取后的水相中加入400mL的乙酸乙酯液进行萃取，分层后，弃去上层的乙酸乙酯相，保留水相。步骤5.第三次萃取分离往第二次萃取后的水相中加入400mL的正丁醇液进行萃取，分层后，弃去下层的水相，保留正丁醇相。步骤6.浓缩各萃取液旋转蒸发真空浓缩(40℃，0.08MPa)三种萃取液，得40mL各浓缩液，用移液管吸取20mL浓缩液于恒重培养皿，在干燥箱内100℃烘6小时，称量，算出其净重，得各种提取物干粉，再取部分干粉溶解在各溶剂中，配置成12.5，25，50mg/mL浓度的各溶液。步骤7.Sephadex LH-20柱分离将萃取后的正丁醇浓缩液20mL置于Sephadex LH-20的凝胶柱上，用70％的甲醇洗脱，自动部份收集器收集，得60个分离试管，分别进行硅胶板分离鉴定和抗菌活性测定，分为4个不同的组分。步骤8.硅胶柱进一步分离第一组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯/甲醇/水(7∶1∶1)洗脱；第二组分用硅胶柱分离(乙酸乙酯/甲醇/水(8∶1∶0.2)洗脱)，再用Sephadex LH-20柱分离(甲醇洗脱)，进一步纯化需用制备柱分离；第三组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯/甲醇/水(8∶1∶1)洗脱，进一步纯化需用制备柱分离；第四组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯/甲醇/水(8∶1∶1)洗脱，进一步纯化需用制备柱分离。步骤9.制备柱分离将每一组分的分离液各自合并，浓缩5～10倍，0.45μm膜过滤后，进入HPLC 9.4～250mm Zorbax ODS制备柱分离。所述的提取方法，其步骤1中，于沸水浴中提取的时间为9～12小时之间。所述的提取方法，其步骤6得到各浓度的提取物萃取液后，需对朝鲜蓟各提取物的抗菌活性进行测定。所述的提取方法，其抗菌活性测定采用孔注入法，方法是将高压灭菌后的琼脂培养基趁液态倒入干燥灭菌的直径9cm培养皿内，冷凝后再倒入一层，每层厚度2mm，待培养基冷凝后，倒入0.3mL菌悬液均匀涂布平板，然后用无菌金属打孔器打成直径6mm，深2mm的小孔3～4个，用无菌针头除去孔内琼脂，吸取不同浓度药液约0.05mL加入孔内，每一种药液作3个重复。然后置于恒温培养箱中培养(细菌，37℃，24小时；霉菌、酵母菌28℃，48小时)，观察抑菌圈大小本专利技术的朝鲜蓟提取物包括叶、花苞、茎等各部位的提取物。其各萃取分离成分对所测试菌株，无论是对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌、酵母或霉菌的生长基本都有抑制作用，而其中以叶子提取物的抑制性最强，其次为花苞提取物，茎的抑菌活性最弱。在所有分离萃取物中，以正丁醇的抑菌活性最强，其次是氯仿和乙酸乙酯。所述的提取方法，其步骤7中，所述分为四个不同的组分，分别是15～21管为第一组分，24～35管为第二组分，37～59管为第三组分，60～80管为第四组分。所述的提取方法，其步骤8得到的天然抗菌活性成分分别是，第一组分得到氯原酸，1，3-二咖啡酰奎宁酸需用制备柱进一步纯化分离；第二组分得到3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸化合物混合物，进一步纯化需用制备柱分离；第三组分得到木犀草素-7-芸香糖甙和木犀草素-7-葡萄糖甙混合物，进一步纯化需用制备柱分离；第四组分得到芹菜素-7-芸香糖甙、芹菜素-7-葡萄糖甙混合物，进一步纯化需用制备柱分离。所述的提取方法，其步骤9得到的天然抗菌活性成分分别是，第一组分得到氯原酸和1，3-二咖啡酰奎宁酸；第二组分得到3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸；第三组分得到木犀草素-7-芸香糖甙和木犀草素-7-葡萄糖甙；第四组分得到芹菜素-7-芸香糖甙、芹菜素-7-葡萄糖甙化合物。所述的提取方法，其步骤9得到天然抗菌活性成分后，需对其最低抑菌浓度(MIC)进行测定。所述的提取方法，其所述活性成分最低抑菌浓度(MIC)测定采用涂平板和稀释肉汤的方法进行，方法是在用来培养细菌的Meller-Hinton肉汤和用于培养真菌Saboraud葡萄糖肉汤中添加浓度梯度从0到20mg/mL.连续双倍递减稀释的三种抽提物和对应的抗生素作对照。分别取0.1mL细菌细胞(106CFU/mL)和真菌细胞或孢子(5×105CFU/mL)的标准悬浮培养液接种到平板上，然后把每个稀释浓度的提取物和抗生素对照涂布到接种后的平板上，在37℃培养箱中培养细菌24小时、在28℃培养箱中培养真菌48～96小时后观察。在稀释肉汤法中，将每个稀释浓度的提取物加入到稀释肉汤培养液中，分别取0.1mL细菌细胞(106CFU/mL)和真菌细胞或孢子(5×105CFU/mL)的标准悬浮培养液接种到试管中，随后将含有细菌的在37℃培养24小时，将含有真菌的在28℃下培养48～96小时后观察。以肉眼检测下，菌株没有增殖的最低浓度和菌株明显增殖的最高浓度的试管和平板培养的提取物的平均值为提取物对该菌株的最低抑菌浓度。本专利技术的朝鲜蓟提取物各活性成分对被测菌株的最低抑菌浓度测定结果表明8种活性成分对大部分被测菌株都具有抑菌活性，其中氯原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-芸香糖甙和木犀草素-7-葡萄糖甙几乎对所有被测菌株都有活性。在被抑制的细菌中既有革兰氏阳性菌也有革兰氏阴性菌，既有球菌也有杆菌，另外对霉菌、酵母菌的抑制现象比细菌更为明显。这表明朝鲜蓟提取物对微生物具有广泛的抑制作用。其最低抑菌浓度在50～200μg/mL之间。一种朝鲜蓟提取物天然抗菌剂，包括朝鲜蓟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种朝鲜蓟天然抗菌剂的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤１．索氏提取称取５００ｇ叶和花苞干粉原料分别置于３０００ｍＬ７５％乙醇溶液的索氏提取器中，于沸水浴中提取，至索氏提取器内的溶液近乎无色为止；步骤２．提取液 蒸发浓缩提取后的约２５００ｍＬ提取液，旋转蒸发真空浓缩（４０℃，０．０８ＭＰａ）至约８００ｍＬ浓缩液；步骤３．第一次萃取分离往浓缩后的约８００ｍＬ溶液中加入４００ｍＬ的氯仿液进行萃取，分层后，弃去下层的氯仿相，保 留水相；步骤４．第二次萃取分离往上次萃取后的水相中加入４００ｍＬ的乙酸乙酯液进行萃取，分层后，弃去上层的乙酸乙酯相，保留水相；步骤５．第三次萃取分离往第二次萃取后的水相中加入４００ｍＬ的正丁醇液进行萃取，分层 后，弃去下层的水相，保留正丁醇相；步骤６．浓缩各萃取液旋转蒸发真空浓缩（４０℃，０．０８ＭＰａ）三种萃取液，得４０ｍＬ各浓缩液，用移液管吸取２０ｍＬ浓缩液于恒重培养皿，在干燥箱内１００℃烘６小时，称量，算出其净重，得各种 提取物干粉，再取部分干粉溶解在各溶剂中，配置成１２．５，２５，５０ｍｇ／ｍＬ浓度的各溶液；步骤７．ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０柱分离将萃取后的正丁醇浓缩液２０ｍＬ置于ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０的凝胶柱上，用７０％的甲醇洗脱，自 动部份收集器收集，得６０个分离试管，分别进行硅胶板分离鉴定和抗菌活性测定，分为４个不同的组分；步骤８．硅胶柱进一步分离第一组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯／甲醇／水（７∶１∶１）洗脱；第二组分用硅胶柱分离（乙酸乙酯／甲醇／水（８∶ １∶０．２）洗脱），再用ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０柱分离（甲醇洗脱），进一步纯化需用制备柱分离；第三组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯／甲醇／水（８∶１∶１）洗脱，进一步纯化需用制备柱分离；第四组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯／甲醇／水（８∶１∶１）洗脱，进一步纯化需用制备柱分离；步骤９．制备柱分离将每一组分的分离液各自合并，浓缩５～１０倍，０．４５μｍ膜过滤后，进入ＨＰＬＣ９．４×２５０ｍｍＺｏｒｂａｘＯＤＳ制备柱分离。...

【技术特征摘要】
1.一种朝鲜蓟天然抗菌剂的提取方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1.索氏提取称取500g叶和花苞干粉原料分别置于3000mL 75％乙醇溶液的索氏提取器中，于沸水浴中提取，至索氏提取器内的溶液近乎无色为止；步骤2.提取液蒸发浓缩提取后的约2500mL提取液，旋转蒸发真空浓缩(40℃，0.08MPa)至约800mL浓缩液；步骤3.第一次萃取分离往浓缩后的约800mL溶液中加入400mL的氯仿液进行萃取，分层后，弃去下层的氯仿相，保留水相；步骤4.第二次萃取分离往上次萃取后的水相中加入400mL的乙酸乙酯液进行萃取，分层后，弃去上层的乙酸乙酯相，保留水相；步骤5.第三次萃取分离往第二次萃取后的水相中加入400mL的正丁醇液进行萃取，分层后，弃去下层的水相，保留正丁醇相；步骤6.浓缩各萃取液旋转蒸发真空浓缩(40℃，0.08MPa)三种萃取液，得40mL各浓缩液，用移液管吸取20mL浓缩液于恒重培养皿，在干燥箱内100℃烘6小时，称量，算出其净重，得各种提取物干粉，再取部分干粉溶解在各溶剂中，配置成12.5，25，50mg/mL浓度的各溶液；步骤7.Sephadex LH-20柱分离将萃取后的正丁醇浓缩液20mL置于Sephadex LH-20的凝胶柱上，用70％的甲醇洗脱，自动部份收集器收集，得60个分离试管，分别进行硅胶板分离鉴定和抗菌活性测定，分为4个不同的组分；步骤8.硅胶柱进一步分离第一组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯/甲醇/水(7∶1∶1)洗脱；第二组分用硅胶柱分离(乙酸乙酯/甲醇/水(8∶1∶0.2)洗脱)，再用Sephadex LH-20柱分离(甲醇洗脱)，进一步纯化需用制备柱分离；第三组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯/甲醇/水(8∶1∶1)洗脱，进一步纯化需用制备柱分离；第四组分用硅胶柱分离，乙酸乙酯/甲醇/水(8∶1∶1)洗脱，进一步纯化需用制备柱分离；步骤9.制备柱分离将每一组分的分离液各自合并，浓缩5～10倍，0.45μm膜过滤后，进入HPLC 9.4×250mm Zorbax ODS制备柱分离。2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1中，于沸水浴中提取的时间为9～12小时之间。3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤6得到各浓度的提取物萃取液后，需对朝鲜蓟各提取物的抗菌活性进行测定。4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤7中，所述分为四个不同的组分，分别是15～21管为第一组分，24～35管为第二组分，37～59管为第三组分，60～80管为第四组分。5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤8得到的天然抗菌活性成分分别是，第一组分得到氯原酸，1，3-二咖啡酰奎宁酸需用制备柱进一步纯化分离；第二组分得到3，5-二咖啡酰奎宁酸和4，5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪勋，朱显峰，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]