穿山龙在制备治疗糖尿病药物中的新应用制造技术

本发明专利技术是关于中药穿山龙在制备治疗糖尿病药物中的新应用，尤其是穿山龙在制备治疗２型糖尿病药物中的新应用，属于中药技术领域。本发明专利技术的优点在于对中药穿山龙发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；穿山龙安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景；本发明专利技术的物质原料穿山龙来源丰富、廉价、制备工艺简单，可以制成多种制剂，使用方便；本发明专利技术的物质配制成的药物能够抑制ＮＦ－κＢ活性，增加ＧＬＵＴ４基因的表达，促进外周组织例如肌肉、脂肪组织对葡萄糖的转运和利用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于中药穿山龙在制备治疗糖尿病药物中的新应用，尤其是穿山龙在制备治疗2型糖尿病药物中的新应用，属于中药

技术介绍
糖尿病是一种常见的多发内分泌疾病，其发病主要原因是由于胰岛素相对或绝对不足，临床表现为多尿、多饮、多食、消瘦、高血糖和尿糖。由于其危害极大，目前已成为全球关注的公共卫生问题。尤其是2型糖尿病中存在胰岛素抵抗；因此，对该病的治疗较为困难。目前临床主要采用噻唑烷二酮类药物进行治疗，但因其引起水肿，肝脏损伤等副作用使其应用得到限。因此，从天然植物中寻找疗效高、副作用低的降糖活性成分是近几年来国内外研究的热点之一。穿山龙为薯蓣植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的干燥根茎，又名野山药、串地龙、地龙骨，性温，味甘、苦，在传统中药中具有活血舒筋、消食利水、祛痰截疟之功效。临床报道其主要活性成分穿龙薯蓣总皂甙对治疗冠心病、抗动脉粥样硬化、降血脂、平川抗炎和抗肿瘤有一定疗效。目前关于穿山龙药理方面的研究主要集中于骨关节病、哮喘，冠心病，抗菌，抗病毒以及免疫抑制作用等。穿山龙化学成份的研究主要集中于其含量丰富的薯蓣皂甙(Dioscin)，其甲醇提取物具有胰酶抑制活性，IC50为5-10μg/mL，水解后可得到薯蓣皂甙元(Diosgenin)，具有止咳、祛痰、脱敏、恢复病变组织、降低胆固醇及刺激肝素细胞生长与胆汁分泌等药理活性，还被广泛用作甾体抗炎药、性激素、女用避孕药的半合成原料。但是穿山龙在制备治疗糖尿病药物中的新应用尚无先例。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了研究和实施穿山龙在治疗糖尿病的新用途，明确该药抗糖尿病药理机制，以专利技术一种穿山龙在制备治疗糖尿病尤其是2型糖尿病的药物中的新应用，从而开发研制出一种新型高效抗糖尿病药物。实际上，本专利技术涉及穿山龙在制备治疗糖尿病药物中的应用，尤其涉及穿山龙在制备治疗2型糖尿病的药物中的新应用。为了更好地理解本专利技术的实质，下面将用穿山龙的药理试验及结果来说明其在制备治疗糖尿病尤其是2型糖尿病的药物中的新用途。本专利技术的药理试验路线制备2型糖尿病动物模型，然后进行药物干预，明确穿山龙抗糖尿病作用机制。1、对象雄性Wistar大鼠58只，体重170±20g，清洁级饲养，整个饲养过程中保持温度18-22℃，湿度40％-60％，人工光照，明暗各12h/d，自由摄食、摄水。基础饲料热卡配比碳水化合物占60％，蛋白质占25％，脂肪占10％(植物脂肪为主)，维生素及矿物质等成分占5％。高脂饲料中碳水化合物20％，蛋白质21％，脂肪59％(脂肪主要来自红花油)。2、方法(1)、造模及治疗方法①、将大鼠按体重随机分为四组，其中正常组10只，其余每组16只。每周称取体重一次。适应性饲养一周，正常组继续饲以普通饲料，其余各组饲以高脂饲料，一个月后在高脂饲料喂养的大鼠中选取体重增长最大的80％的大鼠，给予链脲佐菌素(STZ)30mg/Kg体重腹腔注射(用PH4.2的0.1mol/L的枸橼酸钠配制成2％的溶液，针式滤器滤菌)。正常组腹腔注射枸橼酸钠溶液。一周后剪尾采血以强生血糖仪测定禁食6小时的非空腹血糖，以血糖≥16.7mmol/L为造模成功。共有30只大鼠造模成功，与正常组一起纳入本研究。模型鼠按血糖值随机分为三组，分别为穿山龙组、文迪雅组、糖尿病对照组。②、所有组均饲以普通饲料。穿山龙组以穿山龙汤剂灌胃，穿山龙汤剂是将中药穿山龙煎至含生药0.8g/ml；文迪雅组以文迪雅灌胃，将文迪雅配制为10％悬浊液。剂量均按人与鼠的体表面积折算，每日灌胃一次。正常组和糖尿病对照组均以等体积的蒸馏水灌胃。每两周剪尾取血测血糖一次，以禁食6小时的非空腹血糖下降至正常组平均水平或与造模时相比有显著性差异为治疗有效。治疗有效者处死。至总灌胃三个月时处死。整个实验过程中除自然死亡的大鼠外，数据保留完整的大鼠分别为穿山龙组7只、文迪雅组8只、糖尿病对照组7只。③、各实验阶段(适应性饲养一周时、高脂饮食一月时、注射链脲佐菌素一周时、处死时)均过夜空腹，颈静脉窦穿刺取血，以测定血糖(GLU)，同时分离血清，以Sysmexchemix-180型全自动生化分析仪测定尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)(试剂购自威特曼公司)，并保留血清，与其他实验阶段采集的血清同批测定胰岛素(Ins)。胰岛素的测定采用人胰岛素放射免疫分析试剂盒测定，试剂购自北京北方生物技术研究所。各指标测定质控值血糖为3.72±0.18mmol/l，甘油三酯为1.49±0.06mmol/l，总胆固醇为5.51±0.20mmol/l，胰岛素批内差异＜5％。④、处死方法1％的戊巴比妥钠以20mg/kg腹腔注射麻醉，开胸心尖穿刺取血致死。取肾脏、肾周脂肪组织、股四头肌以液氮保存，并留取肝脏、肾脏以10％中性福尔马林固定，胰腺分两份，分别以10％中性福尔马林及2％戊二醛固定。(2)、免疫组织化学方法肝脏、肾脏NF-κB P65活性测定采用免疫组织化学方法。具体步骤将10％中性福尔马林固定的肝脏、肾脏以石蜡包埋，切片，常规脱蜡水化，3％H2O210分钟阻断内源性过氧化物酶，微波修复抗原95℃5分钟×4次，依次滴加1∶50稀释的一抗(试剂购自Santa Cruz公司)、二抗及DAB显色系统，封片镜检。使用德国欧波同公司的Vidas图样分析系统在高倍镜下依次选择10个肾小球或肝脏的10个低倍镜视野进行阳性细胞计数，以阳性细胞数/肾小球(肝脏1个低倍镜视野)总细胞数为阳性细胞率，最后以每张切片的均值进行比较。(3)、各因子mRNA半定量方法①、脂肪、肌肉、肾脏组织总RNA的提取按照试剂盒说明书进行(试剂购自QIAGEN公司)。取总RNA 50稀释后紫外分光光度仪(BECKMAN DU640 USA)测定吸光度(A)A260和A280，选取A260/A280在1.8-2.0的样本进行实验。②、由总RNA逆转录为cDNA取总RNA 1μg进行逆转录，具体步骤参见试剂盒说明书(试剂购自Promega公司)。cDNA贮存于-20℃待用。③、脂肪组织TNF-αPCR扩增引物序列由DNAstar软件设计而成。上游引物5’CAT GAT CCG AGA TGT GGA ACT GGC 3’；下游引物5’CTG GCT CAG CCACTC CAG C 3’。产物为316bp。以GAPDH为内参照，其引物序列为上游引物5’ACTGCC ACC CAG AAG ACT 3’；下游引物5’GCT CAG TGT AGC CCA GGA T 3’。产物为292bp。由上海生物工程技术公司合成。PCR反应体系为25ul，包括cDNA2μl，上下游引物(5μmol/L)各2μl，Mg2+(25mM)1.2ul，dNTP(10mM)0.5ul，Taq酶1u，10×Buffer2.5μl，补去核酶水至25μl。PCR扩增条件为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸45秒，共36循环，最后72℃终延伸10分钟。GAPDH退火温度为55℃，26循环。④、肾脏TGF-β组织总RNA的提取按照试剂盒说明书进行(试剂购自QIAGEN公司)。PCR扩增引物序列参考文献[1]。上游引物5’TGA ACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
穿山龙在制备治疗糖尿病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.穿山龙在制备治疗糖尿病药物中的应用。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颜刚，陈新焰，许凤，赵世华，
申请(专利权)人：青岛大学医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：95[]