OB-FOLD作为支架用于工程化新的特异性结合物制造技术

本发明专利技术涉及蛋白质工程领域，提供了获得特异性结合选自大量配体家族的靶的稳定分子的手段。特别地，本发明专利技术提供了通过用ＯＢ－ｆｏｌｄ蛋白质作为起始分子的组合突变／选择方法获得特异性结合感兴趣的靶的分子的方法。特别地，所述感兴趣的靶可以是用作起始分子的ＯＢ－ｆｏｌｄ蛋白质的天然靶的不同的化学性质形式。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】OB-FOLD作为支架用于工程化新的特异性结合物本专利技术属于蛋白质工程领域。特别地，本专利技术提供了用于获得特异性 结合选自大量配体家族的靶的稳定分子的手段。大多数天然蛋白质不适于治疗或甚至生物技术应用。蛋白质工程的挑 战是限定有效和广泛的设计新的或改良的具有所需特性的蛋白质的方法。 在耙定特性中，高特异性和亲和性识别配体是非常重要的。对于许多应用， 抗体己被使用，这是由于它们特别适合于结合不同种类的配体如蛋白质， 肽，核酸，糖等。但是由于分子复杂性和/或稳定性不足，通常抗体或它们 的衍生物片段制备困难且昂贵。由于这些原因，最近己发展了使用经组合 突变/选择方法工程化的支架蛋白质替代抗体的方法。目的是当去除抗体的 缺陷时维持它们的有利特性。已报道该策略的成功应用(Binz et al., 2005; Mathonet and Fastrez, 2004)，其中绝大多数的耙是蛋白质和特别地小有机化 合物。本专利技术的目的是提供用于工程化能很好适用于医学或生物技术应用和 能够与多种靶特异性和高亲和力结合的分子的工具，所述靶选自核酸，蛋 白质，碳水化合物或任何其他生物学分子。为此，本专利技术检验假设，即命 名为寡核苷酸/寡糖结合折叠区(OB-fold)的一个特殊蛋白质结构可通过其 结合面的残基的随机化而修饰，同时至少部分保留亲代蛋白质的有利生物 物理学特性(即高稳定性和折叠效率)。由Murzin(Murzin, 1993)首先描述的寡核苷酸/寡糖结合折叠区(OB-fold) 在所有界中发现并在20个染色体调査中排名为第28个最具代表性的折叠 (Qianeta1.，2001)。这个折叠，顶上带有一个两性分子a-螺旋的5链P-桶， 似乎适于多种序列。OB-fold呈现一个(3-折叠结合面，其在可被识别的化合 物类型上赋予显著的多样性，所述化合物是ssDNA、 dsDNA、 RNA、寡糖、 蛋白质、金属离子和催化底物。来自不同蛋白质的几个OB-fold的研究显 示结合核心总是位于结合面的相同位置(Arcus， 2002)。Sac7d具有OB-fold拓扑结构(图la)(Agbacketa1., 1998; Gao etal.， 1998;Robinson et al., 1998; Su et al.， 2000)。它属于来自超嗜热古细菌嗜酸热硫化 叶菌(5W/o/o6ws 的一类小染色体蛋白质。当在DNA中诱导尖锐扭结(sharp kink)时，Sac7d结合双链DNA，不具有任何特定序列 优选性(Robinson et al., 1998)。认为在热硫化叶菌高生长温度时在DNA螺 旋稳定化上发挥作用。(最佳为85。C)。Sac7d非常稳定。它耐热并在Tm 91°C 解折叠，在PH0到IO之间保持天然折叠，当变性剂中点浓度2.8M时，盐 酸胍诱导的变性可逆性发生(McCrary et al., 1996)。与抗体相反，它的分子 组织非常简单。Sac7d是66个氨基酸、只有一个结构域(即OB-fold)和不具 有二硫键的小单体蛋白质(McAfeeetal.， 1995)。已经发现Sac7d的几个截短 形式(McAfee et al.， 1995)。培养瓶培养大肠杆菌可实现过度生产水平达到可 溶性蛋白质10-15mg/l (Edmondson and Shriver, 2001)。 Sac7d和其来自硫磺 矿硫化叶菌(5W/o/o6ws ^//"ton'cw)的相近同系物Sso7d的结构研究显示 两个蛋白质核心是重叠的并主要经由16个残基形成的扭曲区域结合DNA 小沟(Agback et al., 1998; Gao et al.， 1998; Robinson et al., 1998)。本专利技术人已尝试了经体外蛋白质定向进化改变Sac7d的结合特异性的 可能性，其引入参与配体结合的大量残基的随机突变，之后选择与给定靶 结合的变体。更准确地，本专利技术人己构建了大约3><1012变体的大文库，其 相当于随机取代Sac7d结合面的11个残基。这个文库已被用于经核糖体展 示选择能够结合限定蛋白质靶的变体。获得3个蛋白质靶的结合物池 (pool),其亲和力在几百纳摩尔范围。在另一个方法中，本专利技术人扩大了 潜在的结合区域达到13和14个残基。这些新文库被用于选择前述的靶之 一(PulD-N)和获得亲和力在皮摩尔范围的特异性结合物。因此令人惊奇地， 本专利技术人证明普通DNA结合物(Sac7d)可进化为具有高特异性和亲和力的 特异性蛋白质结合物。这个证明提供了证据，即可以从Sac7d或其他 OB-fold衍生出对于实质上任何类型配基的结合物，例如通过使用以下更详 细描述的方法。因此，本专利技术的第一方面是OB-fold蛋白质作为起始分子用于通过组 合突变/选择方法获得特异性结合靶、特别是起始OB-fold蛋白质不结合的 耙即与用作起始分子的OB-fold蛋白质的耙不同的耙的分子的应用。在下 文中，起始OB-fold蛋白质的靶将被称为"天然靶"，然而选择步骤中使用的靶将被指定为"感兴趣的靶"。在一个优选的实施方案中，感兴趣的靶子有 不同于天然靶的化学性质(例如蛋白质比/核酸，和金属离子或糖比/蛋白质)。因此，本专利技术的一个特别方面是天然结合核酸的OB-fold蛋白质作为起始分子用于通过组合突变/选择方法获得特异性结合不同于核酸的靶(例如蛋白质)的分子的应用。天然结合蛋白质的OB-fold蛋白质作为起始分 子用于通过组合突变/选择方法获得特异性结合非蛋白质靶(例如核酸)的 分子的应用也是本专利技术的一部分。依据本专利技术，短语"OB-fold蛋白质"被指定为任何多肽，其包含或由具 有OB-fold拓扑结构的结构域组成，如(Murzin, 1993)和(Arcus, 2002)所述。 这个拓扑结构相当于在一个末端顶部有一个两性分子a-螺旋的5链P桶的 构造。谈到CATH蛋白质结构分类(Pearletal., 2003)， OB-fold拓扑结构相 当于2.40.50折叠家族(CATH数据库版本3.0.0: Released May 2006)。这样的 OB-fold蛋白质可以是天然蛋白质(即具有与天然蛋白质相同序列的分离纯 化或重组的蛋白质)或工程化的蛋白质(例如天然蛋白质的片段或包含来自 第一个蛋白质的OB-fold结构域和来自另一个蛋白质的另一部分的融合蛋 白)。依据本专利技术可使用的OB-fold蛋白质的非限定性实例是Sac7d， Sso7d， SEB的N末端结构域(Papageorgiou et al.， 1998)，志贺样毒素lie (PDB 2bosa) 的链A，人嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2， PDB ltvxA)，棕色固氮菌 G4zoto6a"w W"e/aw&7)的钼结合蛋白质(modg) (PDB lh9j)， SPE-C的N末 端结构域(Roussel et al.， 1997)，大肠杆菌(Eco")志贺样毒素的B5亚基， Cdcl3(Mitton-Fry et al.， 2002)，人Y-box蛋白质YB-1的冷休克DNA结合结 构域(Kloks et al.， 2002)，大肠杆菌无机焦磷酸酶EPPas本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＯＢ－ｆｏｌｄ蛋白质作为起始分子通过组合突变／选择方法获得特异性结合靶的分子的应用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F佩科拉里，P阿扎瑞，
申请(专利权)人：巴斯德研究院，国立科学研究中心，
类型：发明
国别省市：FR[]