检测系统及其应用技术方案

一种用于检测分子缔合的系统，所述系统包括：ｉ）第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的第一相互作用组；ｉｉ）第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；ｉｉｉ）第三试剂，其包括第三相互作用组；ｉｖ）调控剂　和ｖ）检测器；其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合；以使由所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成监测所述第一和第三试剂的缔合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于检测分子缔合的系统。本专利技术具有检测不同分子的缔合并且由此检测异源-二聚体和/或异源-寡聚体的形成的具体应用。
技术介绍
将在蛋白质缔合的情形中讨论本专利技术的背景。然而，本专利技术的范围不应该理解为受限于此。在细胞中蛋白不以分离形式起作用，而是以稳定的或瞬时的复合物形式起作用，蛋白-蛋白相互作用是蛋白功能的重要决定因素(Auerbach等,(2002),蛋白质组学(尸rafeo/m'") ，2,611-623)。此外，蛋白和蛋白复合物与其它细胞成分如DNA、 RNA和小分子相互作用。理解参与这些相互作用的个体蛋白以及它们的相互作用二者对于更好地理解生物学过程是重要的。存在一些工具，用来在体外、在细胞表面通过交联的潜力共免疫沉淀、或在体内证明蛋白-蛋白相互作用，其包括，例如，荧光RET的共振能量转移(RET)技术(FRET)和生物发光RET的共振能量转移(RET)技术(BRET)。G-蛋白偶联受体(GPCRs)的相互作用代表蛋白缔合的生理学和潜在药学相关性、且特别是异源-二聚体和/或异源-寡聚体的相关性的极佳实例。如Milligan (Milligan, (2006),今日药物开发(2>wg ZXscove^ 7b&力，11,541-549)所观察的，同源-二聚化和同源-寡聚化对于药物开发工业具有有限的启示，而"GCPR异源-二聚体和异源-寡聚体的差别性药理学、功能和调控提示选择性靶向不同组织中的GPCRs的方式，并且暗示一些药物试剂的功能机制在体内可能不同于由依赖于单一 GPCR的异源表达的简单配体筛选程序所预测的功能机制"。共免疫沉淀已经用来鉴定GPCR异源二聚体(Jordan BA和Devi LA(1999) G-蛋白-偶联受体异源二聚化调控受体功能(G-protein-coupled receptor heterodimerization modulates receptor function) 自然(TVafwre) 399, 697-700)。然而，共免疫沉淀不能区分组成型和随机型缔合。特别地，存 在对在细胞裂解和溶解后发生的假象(artefactual)聚集的关注(Kroeger KM等(2003)神经内分泌途径中的G-蛋白偶联受体寡聚化(G-protein coupled receptor oligomerization in neuroendocrine pathways).神经内分泌 学前沿(尸ra"f. A^wraemfocn'"o/.) 24,254-278)。此外，共免疫沉淀不适用 于自动化或高通量筛选。荧光共振能量转移(FRET)能够检测体内蛋白-蛋白相互作用(Forster， (1948),物理学年刊(*".尸/^.)2，57-75)。在克隆了绿色荧光蛋白(GFP) 及其具有不同光谱特征的突变变体时，该技术变得特别具有吸引性并且适用于在活细胞中进行的测定法。这允许通过融合编码DNA序列而将GFP 及其变体遗传附着到任何靶蛋白上(Heim等，(1994), /W^IS. 91, 12501-12504)。 FRET能够监测在细胞内任何位置发生的相互作用。FRET 可以在任何细胞类型(哺乳动物、酵母、细菌等)或无细胞系统中进行确定。 其可以通过荧光光谱法、荧光显微镜、和荧光激活的细胞分选法(FACS) 进行检测。生物发光共振能量转移(BRET)是己经开发来研究体内蛋白-蛋白相 互作用的另一种技术(Xu等,(1999),授W. ,, 96, 151-156; Eidne等, (2002),内分泌学和新陈代谢趋势(7Ve"A五M必cn'". Meto6o/. ) 13, 415-421)。与FRET相同，BRET允许在活细胞或无细胞系统内检测，并 且其不局限于特定的细胞区室。在使用FRET或BRET评估标记的蛋白之间的直接相互作用时，很难 区分背景信号与由组成型相互作用导致的信号。此外，由于RET依赖于 能量供体和受体之间的相对方向和距离，相互作用亲和性不直接与信号强 度相关。已经提议将'饱和，BRET 作为区分背景和组成型信号的方法，然而，为了产生饱和曲线，这需要相 对于供体-标记的蛋白表达增加浓度的受体-标记的蛋白，并且绝不能是高 通量的。前述讨论仅意欲促使理解本专利技术。其不应该解释为以任何方式限制本 专利技术下述描述的范围或应用，其也不应该解释为承认所讨论的任何信息属 于在优先权日时相关领域技术人员的公知常识。
技术实现思路
本专利技术人己经开发了能够克服或至少减少在蛋白质缔合分析中鉴定 的一些问题的检测系统。最重要地，使用依赖于外部调控的信号，本专利技术的系统能够鉴定在不 同分子之间产生的潜在的组成型缔合(即，异源二聚体)以及多个拷贝的相 同分子产生的那些(即，寡聚体)，由此赋予区分组成型缔合和随机性缔合 的能力。在本专利技术的第一方面中，提供一种用于检测分子缔合的系统，所述系 统包括i) . 第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的第一相互作用组；ii) .第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；iii) .第三试剂，其包括第三相互作用组；iv) .调控剂；和v) . 检测器；其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号； 并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的 缔合；以使由所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信 号组成监测所述第一和第三试剂的缔合。所述系统还可以包括报道成分引发物，其中仅在存在所述报道成分弓i 发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检 测的信号。在本专利技术的第二方面中，提供一种检测分子缔合的方法，所述方法包括下列步骤i) . 提供第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一相互作用组；ii) .提供第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；iii) .提供第三试剂，所述第三试剂包括第三相互作用组；iv) . 提供调控剂；其中；所述第一和第二报道成分的接近产生信号；并且其中所 述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的 缔合；然后v) . 检测和/或监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的任何信号；从而通过所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号 组成监测所述第一和第三试剂的缔合。在检测和/或监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的任何信号 的步骤之前，所述方法还可以包括提供报道成分引发物的步骤，其中仅在 存在所述报道成分引发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生 能够由检测器检测的信号。在本专利技术的一种形式中，提供报道成分引发物和提供调控剂的步骤， 在提供第一、第二和第三试剂的步骤之后发生。在本专利技术的特别有利的形式中，所述第一、第二和第三试剂通过在向 其中引入调控剂的细胞中共表达的方式提供。在第三方面中，本专利技术提供一种用于确定当第二蛋白与第一蛋白缔合 时，测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的方法，所述方法包 括下列步骤a).使所述测试化合物与系统接触，所述系统包括i) . 第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一蛋白；ii) . 第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测分子缔合的系统，所述系统包括：　ｉ）．第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的第一相互作用组；　ｉｉ）．第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；　ｉｉｉ）．第三试剂，其包括第三相互作用组；　ｉｖ） ．调控剂；和　ｖ）．检测器；　其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合；以使由所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成监 测所述第一和第三试剂的缔合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯文唐纳德乔治普夫勒格，路斯马里泽贝尔，亨布恩西伊，卡琳安艾德尼，
申请(专利权)人：戴麦里克斯生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[]