本发明专利技术属于生物药学技术领域，具体涉及一种快速运载抗肿瘤药物进入细胞核、有效杀灭肿瘤细胞的高效细胞核靶向药物载体蛋白以及编码这种高效细胞核靶向药物载体蛋白的基因。本发明专利技术的高效细胞核靶向药物载体包含至少一个细胞核定位序列、至少一个穿膜序列、至少一个多聚组氨酸序列。本发明专利技术的高效细胞核靶向药物载体既可以增强肿瘤细胞对该载体偶联的抗肿瘤药物的敏感性，又可以靶向性地运载抗肿瘤药物进入肿瘤细胞的细胞核，发挥抑制肿瘤细胞核酸合成的功效，本发明专利技术的高效细胞核靶向药物载体具有快速、靶向的双重作用，大幅降低了抗肿瘤药物的用药剂量，从而降低了抗肿瘤药物的毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物药学
，具体涉及一种具有高效穿透细胞膜作用和细胞核 靶向作用的高效细胞核靶向药物载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
目前临床上使用的抗肿瘤药物主要的作用机理是针对核酸合成过程中的不同环 节，因此希望抗肿瘤药物能够穿过肿瘤细胞的细胞膜并能迅速进入细胞核内发挥药物作 用。所以提高抗肿瘤药物的穿越细胞膜的能力和核靶向性，快速到达作用部位，这是当今迫 切需要解决的科学问题。化疗在一定程度上延长了患者的生存期，但同时对正常细胞的损伤也很大，尤其 是在全身使用化疗药物时，药物通过血液循环达到人体的各个组织并对正常细胞也产生了 杀伤作用，引起全身的不良反应，严重影响治疗的最终效果。因此，治疗肿瘤药物的细胞靶 向和进一步的细胞核靶向一直是生物医学界的热点问题，其中尤其是新型抗肿瘤药物的核 靶向载体的研发显得尤为重要，也是一直以来研究者不懈努力的目标。从抗肿瘤药物靶向治疗的角度看，把药物定向地输入到肿瘤发生的部位，临床上 已采用的介入治疗，就是将抗癌药物直接注入肿瘤发生的靶器官，以消除癌块，这是器官水 平的靶向治疗。然而，由于目前临床上使用的抗肿瘤药物主要的作用机理是针对核酸合成 过程中的不同环节，输入到肿瘤发生的部位的抗肿瘤药物必须要迅速进入肿瘤细胞以及细 胞核，才能达到迅速杀灭肿瘤细胞的目的。例如阿霉素(Adriamycin/Doxorubicin，ADM)通 过抑制细胞核内DNA及RNA的合成达到杀灭肿瘤细胞的作用。因此，抗肿瘤药物载体应该 不仅能快速运载治疗性药物穿过肿瘤细胞膜，而且能使治疗药物进入肿瘤细胞发挥药效的 亚细胞结构，这样才能既不影响正常细胞的生长，降低药物的毒副作用，又能充分发挥抗肿 瘤药物的药效。因此，抗肿瘤细胞药物载体的核靶向功能至关重要，是长期以来影响抗肿瘤 药物药效性的关键。1988年著名的科学杂志“Cell”报道的人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白及随后 报道的单纯疱疹病毒的VP22蛋白，它们的转导效率高于目前所有的基因治疗载体。进一步 研究表明HIV-TAT、VP22蛋白等能够穿过细胞膜进入细胞是因为在这些蛋白质分子中包 含了由几个或几十个氨基酸残基组成的并且富含精氨酸(Arginine，Arg)的肽链，称为穿 膜序列。随后对穿膜序列的研究证实它与各种大分子或生物活性治疗药物偶联后能携带 原先不能进入细胞的物质穿过细胞膜进入细胞并在细胞中表达，发挥其细胞生物学效应。 穿膜序列的发现为我们寻找高效抗肿瘤药物载体提供了思路，也为我们寻找抗肿瘤药物的 穿膜运载载体奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型抗肿瘤药物的载体，它能携带抗肿瘤药物快速穿过 肿瘤细胞膜屏障并能靶向性地进入肿瘤细胞的细胞核，实现抗肿瘤药物对肿瘤细胞的高效性杀伤，降低抗肿瘤药物的使用剂量，降低对正常细胞毒副作用。本专利技术提供的这种新型高 效抗肿瘤药物的载体是一种具有细胞核靶向性的蛋白质，可以在制备抗肿瘤药物中得到广 泛的应用。本专利技术从运载抗肿瘤药物穿膜和抗肿瘤药物发挥作用的亚细胞位点这两个方面 入手，开发出双重功效性药物载体。这种药物载体既能使携带的药物快速穿过细胞膜屏障， 使药物快速进入肿瘤细胞，又能迅速介导抗肿瘤药物的入核转运，使药物有效进入细胞核 从而发挥杀灭肿瘤细胞的作用。使用本专利技术的药物载体能减少抗肿瘤药物的使用剂量，并 显著降低了药物的毒副作用，实现了对肿瘤细胞的高效杀灭。迄今为止国内外尚未报道过本专利技术的高效细胞核靶向药物载体。尚未见用这种药 物载体提高抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞能力的报道。本专利技术所述的一种高效细胞核靶向药物载体，该药物载体蛋白包含至少一个核定 位序列、至少一个穿膜序列和至少一个多聚组氨酸肽序列，核定位序列通过至少一个共价 键与所述的穿膜序列相偶联，所述的多聚组氨酸肽序列通过至少一个共价键与所述的核定 位序列或穿膜序列相偶联，形成三者的线性重组蛋白。其中所述的核定位序列是来自人体蛋白的多肽序列，具有单一的核靶向功能，其 具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，所述的穿膜序列具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列，所述的多聚组氨酸肽序列具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。进一步，前面所述的一种高效细胞核靶向药物载体的多聚组氨酸肽序列位于该药 物载体蛋白的N末端或者C末端。共价键是肽键。进一步，该药物载体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。前面所述的一种高效细胞核靶向药物载体在制备抗肿瘤药物中的具有广泛应用。 该药物载体通过至少一个共价键与抗肿瘤药物相偶联，形成高效核靶向载体-抗肿瘤药物 的共价偶联物。抗肿瘤药物为阿霉素ADM、阿糖胞苷CPT、雷替曲塞Raltitrexed或顺钼 Cisplatin Injection0进一步，本专利技术还涉及一种编码前面所述的高效细胞核靶向药物载体蛋白的基 因，其具有SEQ ID NO :5所示的DNA序列。本专利技术还涉及一种重组表达载体，其是SEQ ID NO 5所示DNA序列的基因与表达载体pEI^8a、pMA5或pGT22重组构建的重组表达载体。本专利技术实施例1中的高效细胞核靶向药物载体的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所 示，它是SEQ ID NO :1序列与SEQ ID NO :2序列和SEQ ID NO :3序列顺次重组而成，实施例 2中所制备的“细胞核靶向载体-抗肿瘤药物”的共价偶联物中，载体的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，抗肿瘤药物是阿霉素(AdriamyCin，ADM)，实施例3中“细胞核靶向载体-抗 肿瘤药物”的共价偶联物对肿瘤细胞有效性杀伤作用中，所应用的靶细胞是Hela细胞。本专利技术的特点是以来自人体蛋白的核定位序列为药物载体蛋白的核心序列，同时 重组了穿膜序列，充分体现出载体蛋白的穿膜功能和核靶向性，使本专利技术的抗肿瘤药物载 体具有双重功效。附图说明图1 实施例1制备的pMA5-PP107H重组表达载体的测序谱图；图2 实施例1制备的重组表达载体pMA5-PP107H构建示意图3 纯化得到的重组药物载体蛋白PP107H的SDS-PAGE图谱；其中M:蛋白质 Marker ；A :PP107H ；图 4 :PP107H-ADM 纯度分析图；图5 :PP107H-His载体与ADM的偶联的荧光分光光度法分析图；图6 药物载体PP107H增强抗肿瘤药物ADM对HeLa细胞杀伤作用分析图；其中， 以对照细胞为100% ；图7 药物载体PP107H加速ADM进入肿瘤细胞核并使ADM在肿瘤细胞中聚集分析 图。其中，ADM的免疫荧光显示出ADM的存在部位，DAPI染色的部位显示出细胞核的区域。具体实施例方式实施例1制备高效细胞核靶向药物载体PP107H，包括以下步骤(1)设计本专利技术的药物载体蛋白序列本专利技术的高效细胞核靶向药物载体PP107H的设计使得其完整氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，它包含了 1个SEQ ID NO 1(核靶向)序列，1个SEQ ID NO 2 (穿膜)序列 和1个SEQ ID NO 3 (组氨酸标签)序列；1个穿膜序列SEQ ID NO 2顺次与1个核靶向序 列SEQ ID NO :1和1个组氨酸标签序列SEQ ID NO :3重组形成高本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效细胞核靶向药物载体，其特征在于：该药物载体蛋白包含至少一个核定位序列、至少一个穿膜序列和至少一个多聚组氨酸肽序列，核定位序列通过至少一个共价键与所述的穿膜序列相偶联，而所述的多聚组氨酸肽序列通过至少一个共价键与所述的核定位序列或穿膜序列相偶联，形成三者的线性重组蛋白序列，其中所述的核定位序列具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的氨基酸序列，所述的穿膜序列具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的氨基酸序列，所述的多聚组氨酸肽序列具有ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张应玖，周旺，邹雪，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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