一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法，属于生物技术领域。本发明专利技术涉及应用可特异性识别藻毒素的抗体来制备一种藻毒素免疫亲和层析填料和免疫亲和层析柱及其使用方法。其目的是为了方便从水、水产品、藻类及其制品的提取液中“一步法”富集纯化藻毒素，纯化后的样品进ＨＰＬＣ或ＬＣ－ＭＳ等进行定性定量分析。本发明专利技术中所制备的藻毒素免疫亲和层析柱对一种藻毒素特异性强，纯化效果显著，明显优于现有的固相萃取方法。该藻毒素免疫亲和层析柱提高了富集和纯化的效率，从而提高了检测方法的灵敏度和准确性，制备方法简单，可重复使用。
【技术实现步骤摘要】
，属于生物
技术背景最近的调查表明，由于污染的原因，亚太地区54%的湖泊富营养化，欧洲、 非洲、北美洲和南美洲的比例分别是53%， 28%， 48%和41%，我国则是60%。 在富营养化的淡水水体中，当有适宜的条件时，水体中的蓝藻短时间内大量繁 殖并聚集的生态异常现象称为水华(也称湖靛)。蓝藻水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，甚至在岸边大量堆积。 在藻体大量死亡分解的过程中，不但散发恶臭，破坏景观；同时大量消耗水中 溶解氧，使鱼类窒息死亡；尤其是蓝藻能释放生物毒素——藻毒素(主要是微 囊藻毒素)，这些次级代谢产物严重危害人类和其他生物的安全。1996年巴西一 透析中心，因透析液遭微囊藻毒素污染导致130名病人中有116人出现异常症 状，并有53人最终死亡。我国对微囊藻毒素曾作过相关的调查，结果表明南方 几个省市的各种水体均有不同程度的微囊藻毒素污染，其中以沟塘水、河水、 湖水较为严重。对我国肝癌高发区江苏海门和启东两地进行了饮水与肝癌的病 例对照和前瞻性研究，结果显示饮河水居民患肝癌的危险较饮井水或自来水居 民高。有学者认为微囊藻毒素是引起我国南方肝癌高发的主要危险因素之一。藻毒素对饮水安全的威胁越来越严重。世界卫生组织制定了饮用水中微囊 藻毒素-LR (微囊藻毒素中毒性最强、含量较高的一种)的控制标准为l吗/L。 我国2001年版的"生活饮用水卫生规范"参考了世卫组织的标准。GB 5749-2006 生活饮用水卫生标准也规定饮用水中的微囊藻毒素-LR的限值为0.001mg/L，此 标准2007年7月1日起开始执行。藻毒素不但存在于饮用水中，而且能够在鱼类或贝类中富集、通过食物链 传递进入人体。 一些以藻类为原料的食品、保健品如螺旋藻等，据报道也含有 藻毒素。研究表明蓝绿藻对于湖边，池塘边生活的人及动物会产生危害。WHO 暂定的藻毒素临时可耐受的每日摄取量为0.04吗(kg，d)。因此水产品、以藻类 为原料的食品、保健品中的藻毒素的检测也刻不容缓。而要保证饮用水、水产品、藻类制品中藻毒素的限量，建立快速、灵敏、 准确的藻毒素检测分析方法至关重要。藻毒素是一组环状七肽， 一般结构为环 (-D-Ala-L-X-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)。其中L为左旋；D为右旋。 MeAsp为D-赤-P -甲基天冬氨酸；Adda为(2s,3s,8s,9s)-3-氨基-9-甲氧基-2,6，8-三 甲基-10-苯基-4，6-二烯酸；Mdha为N-甲基脱氢丙氨酸。其中2、 4位氨基酸X 和Z为两种可变的氨基酸，目前已发现下列三种XZ组合的藻毒素毒性较大 LR、 RR禾卩YR，其中L、 R、 Y分别代表Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Tyr(酪氨 酸)。由于XZ的不同及MeAsp和Adda的甲基化或去甲基化产生的差异，可以 形成多种不同的微囊藻毒素异构体。目前已从不同微囊藻菌株中分离、鉴定了 70多种微囊藻毒素结构。目前针对藻毒素的检测以HPLC、 LC-MS或GC-MS等仪器检测为主，其前 处理要用固相萃取柱富集，而固相萃取柱无特异性，会引入许多杂质，干扰检 测结果，有时测定值与实际值相去甚远。本专利技术——藻毒素免疫亲和层析柱，就是针对固相萃取柱在藻毒素检测中 出现的不足所研制的。免疫亲和层析柱是利用免疫亲和层析技术，基于免疫反应的基本原理，利 用生物体内抗体大分子具有与某些相应抗原专一性可逆结合的特性和色谱差速 迁移理论，实现目标物的分离与分析。将目标物相应抗体(单抗或多抗)作为 固定相固定在介质上，制成免疫亲和介质，然后填入柱中，使用时，抗原样品 组分与吸附剂上的抗体发生抗原-抗体结合反应而被保留在柱上，其他成分则直 接被洗脱，随后再使用适当的洗脱剂将待测的抗原洗脱下来，从而达到富集、 纯化的目的。由于抗体与抗原作用具有高度的专一性，因此能够去除绝大部分 杂质，通过一次纯化就能提纯1000-10000倍。纯化后的样品进HPLC或LC-MS 等进行定性定量分析。免疫亲和层析在与藻毒素类似的真菌毒素的检测中已广泛应用，真菌毒素 的免疫亲和层析柱已经非常成熟。其中黄曲霉毒素的免疫亲和层析已被列入新 的国标中(GB18980-2003乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定——免疫亲和层析 净化高效液相色谱法和荧光光度法，GB18979-2003食品中黄曲霉毒素的测定 ——免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，是为 了解决从水、水产品、藻类及其制品的提取液中"一步法"提取净化藻毒素。首先制备出针对藻毒素的特异性好，分离纯化效果明显的免疫亲和层析柱， 以及建立免疫亲和层析柱与HPLC、 HPLC-MS等联用检测藻毒素的快速、准确 的检测方法，并且最终能建立水、藻类制品、保健品、水产品、食品等不同样 品的标准检测方法。本专利技术的技术方案一、 藻毒素免疫亲和层析柱制备步骤如下(1) 将所需量的藻毒素抗体单抗或多抗，溶于pH 8.3含有0.5 MNaCl 的0.1 M NaHC03缓冲液中，每毫克藻毒素抗体冻干粉末用10 -50mL缓冲液溶 解；(2) 称取适量溴化氰活化的琼脂糖冻干粉末，用适量lmM的稀盐酸使其 溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质，lg琼脂糖干粉溶胀为3.5mL凝 胶，lmL琼脂糖凝胶结合0.5-10 mg抗体；(3) 将溶胀后的琼脂糖凝胶在pH 8.3含有0.5 MNaCl的0.1 MNaHC03缓 冲液中与(1)制备得到的抗体溶液均匀混合，并在室温下震荡充分反应1-3小 时，或在4。C下过夜；(4) 用pH 8.3含有0.5 MNaCl的0.1 MNaHC03缓冲液洗去未与琼脂糖凝 胶结合的游离抗体，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；(5) 将琼脂糖-抗体偶联复合物转入pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，或pH 8.0的含0.5 MNaCl的1M乙醇胺溶液中，保持1-3小 时，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；(6) 步骤(5)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用不少于5倍载体体积的pH 4.0的含0.5 MNaCl的0.1 M醋酸缓冲液洗，和用不少于5倍载体体积的pH 8.0 的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓冲液洗，此洗涤过程重复三次；(7) 防腐处理步骤(6)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段 时间，应使用含有1 / 10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后 放入包装袋或瓶中在4"C中密闭保存；(8) 装柱将步骤(6)或(7)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入层析 柱或固相萃取空柱管中，即制成藻毒素免疫亲和层析柱；(9) 保存琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的藻毒素免疫亲和层析柱切勿 冷冻，保存在4'C的冰箱内，l年之内性能稳定；(10) 柱的再生用4-10个柱床体积pH8.5含0.5MNaCl的0.1M Tris—HCl 缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流 清洗免疫亲和层析柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡免疫亲和层析柱后保存在 4'C冰箱内供下次使用，免疫亲和层析柱经过再生后可再次使用，每根本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备方法，其特征是制备步骤如下：（１）将所需量的藻毒素抗体：单抗或多抗，溶于ｐＨ８．３含有０．５ＭＮａＣｌ的０．１ＭＮａＨＣＯ↓［３］缓冲液中，每毫克藻毒素抗体冻干粉末用１０－５０ｍＬ缓冲液溶解； （２）称取适量溴化氰活化的琼脂糖冻干粉末，用适量１ｍＭ的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质，１ｇ琼脂糖干粉溶胀为３．５ｍＬ凝胶，１ｍＬ琼脂糖凝胶结合０．５－１０ｍｇ抗体；（３）将溶胀后的琼脂糖凝胶在ｐＨ８．３含 有０．５ＭＮａＣｌ的０．１ＭＮａＨＣＯ↓［３］缓冲液中与（１）制备得到的抗体溶液均匀混合，并在室温下震荡充分反应１－３小时，或在４℃下过夜；（４）用ｐＨ８．３含有０．５ＭＮａＣｌ的０．１ＭＮａＨＣＯ↓［３］缓冲液洗去 未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体，得到琼脂糖－抗体偶联复合物；（５）将琼脂糖－抗体偶联复合物转入ｐＨ８．０的含０．５ＭＮａＣｌ的０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，或ｐＨ８．０的含０．５ＭＮａＣｌ的１Ｍ乙醇胺溶液中，保持１－３小 时，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；（６）步骤（５）得到的琼脂糖－抗体偶联复合物用不少于５倍载体体积的ｐＨ４．０的含０．５ＭＮａＣｌ的０．１Ｍ醋酸缓冲液洗，和用不少于５倍载体体积的ｐＨ８．０的含０．５ＭＮａＣｌ的０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ洗，此洗涤过程重复三次；（７）防腐处理：步骤（６）制备好的琼脂糖－抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有１／１００００叠氮钠的ＰＢＳ缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在４℃中密闭保存，待用； （８）装柱：将步骤（６）或（７）得到的琼脂糖－抗体偶联复合物填充入层析柱或固相萃取空柱管中，即制成藻毒素免疫亲和层析柱；（９）保存：琼脂糖－抗体偶联复合物或填充好的藻毒素免疫亲和层析柱切勿冷冻，保存在４℃的冰箱内，１年之内性能稳定 ；（１０）柱的再生：用４－１０个柱床体积ｐＨ８．５含０．５ＭＮａＣｌ的０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，和用４－１０个柱床体积ｐＨ４．５含０．５ＭＮａＣｌ的０．１Ｍ醋酸钠缓冲液轮流清洗免疫亲和层析柱２次，再用ＰＢＳ缓冲液充 分平衡免疫亲和层析柱后保存在４℃冰箱内供下次使用，免疫亲和层析柱经过再生后可再次使用，每根免疫亲和层析柱可反复再生使用５－１０...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖付刚，张敬平，赵晓联，钮伟民，汤坚，赵春城，蔡建荣，孙蔚榕，
申请(专利权)人：无锡市疾病预防控制中心，江苏省微生物研究所有限责任公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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