通过微粒的有选择性的激励来进行核酸定序制造技术

通过使用一个或者多个反应物对微粒进行定序反应、在激励图案中有选择地激励微粒、以不足以分辨个别微粒的分辨率对微粒进行光学成像以及使用与激励图案有关的信息来处理微粒的光学图像以确定光学签名的存在或者不存在（这表明核酸的序列信息）来对核酸微粒进行定序。一种用于微粒的光学激励的装置包括递送第一激光束的光纤和耦合到光纤的干涉图案生成模块。干涉图案生成模块将第一激光束拆分成第二激光束和第三激光束并且通过第二激光束与第三激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励微粒的激励图案。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要地涉及核酸定序领域并且更具体地涉及一种用于通过微粒的有选择性的激励来进行DNA(脱氧核糖核酸)定序的方法和系统。
技术介绍
图1图示了利用微粒的常规DNA定序方法。图1的方法通过定序反应104、微粒的无选择性的激励106和光学签名(opticalsignature)检测108的循环来从微粒阵列102中导出DNA序列数据112。微粒阵列102中的各微粒通常包含如下DNA分子，这些分子具有待确定的未知序列和在定序反应中使用的已知序列。数以千计到数以百万计(到可能数以十亿计或者更多)的这些微粒分布和固定于玻璃基片的表面上，如图2中在概念上所示，该示了微粒阵列102的例子。微粒阵列102包括分布和固定于基片202上的DNA定序微粒204。微粒204可以采用许多形式，比如1微米直径的珠子，这些珠子覆盖有通过油包水乳剂PCR(聚合酶链反应)技术放大的DNA分子或者通过桥放大技术放大的DNA分子簇或者个别未放大的DNA分子。微粒204可以随机(例如，间隔不规律)或者以有序图案(例如，间隔规律的图案，比如方形网格图案或者六边形网格图案)分布于基片202上。基片202通常由玻璃制成并且位于贯流分析池(flowcell)内，这允许微粒204暴露于一系列反应物以进行定序反应。在各定序反应循环结束时，各微粒常常由于并入四种荧光团(比如Cy3、Cy5、德克萨斯红(Texas Red)和荧光共振能量传送(FRET)对)之一而呈现光学签名，该光学签名揭示DNA的对应碱基，即腺嘌呤(縮写为a)、胞嘧啶(縮写为c)、鸟嘌呤(縮写为g)和胸腺嘧啶(縮写为t)。 图3A-图3C图示了可以用于DNA定序的不同类型的个别定序微粒。图3A图示了由覆盖有克隆DNA分子304的1微米直径的珠子302形成的个别微粒204，这些分子先前已经通过油包水乳剂PCR技术来放大。珠子302直接附着到流体306中的基片202。图3B图示了个别微粒204，该微粒作为附着到基片202并且放置于流体306中的克隆DNA分子304的簇。DNA分子先前已经通过桥放大技术来放大。图3C图示了个别微粒，该微粒作为附着到基片202并且放置于流体306中的单个DNA分子304。对单个DNA分子304无放大地进行定序。 回到图1以及图2和图3A-图3C，利用微粒的DNA定序包括对微粒阵列102进行定序反应104以使各微粒204呈现对DNA序列信息进行揭示的光学签名。微粒阵列102暴露于定序反应物，这实现以大规模并行方式进行各定序反应循环。例如， 一个定序反应循环可以包括杂化锚定引物并且绑扎有荧光标记的查询引物的池。在定序反应140的各循环结束时，各微粒呈现对与该微粒关联的DNA序列信息进行揭示的光学签名。例如，光学签名可以归因于并入与DNA 304的碱基a、c、g和t对应的四种荧光团之一。 下一步是光学激励106微粒204并且检测108微粒的光学签名。如将参照图4A-图4C说明的那样，常规光学激励为无选择性的。多次重复反应104、无选择性的激励106和光学签名检测108的这一循环以对各微粒204中的DNA 304进行定序。从这一过程输出DNA序列数据112。 利用微粒的常规DNA定序方法受困于低吞吐量(以每秒的碱基为单位进行测量)， 因为对微粒的光学签名进行检测的速率有限。这主要由于如在常规DNA定序方法中使用的 那样使用常规无选择性的激励图案、继而使用光学显微镜方法的光学成像。图4A-图4C图 示了用来激励微粒以便使用光学显微镜方法来后续成像的常规无选择性的激励图案。具体 而言，图4A图示了与基片202上的微粒204 —起使用的宽场激励图案402，其中照射视场 (FOV)中的所有微粒。图4B图示了线扫描激励，其中微粒204由扫描基片202的光线402 照射。图4C图示了斑扫描激励，其中微粒204由扫描基片202的光斑406照射。 可以通过各种手段来生成常规无选择性的激励图案。通常通过在Kohler外照射 结构中经过显微镜光学链聚焦电弧灯源或者通过在轴外或者全内反射(TIR)照射结构中 陡角度照耀激光源来生成宽场激励图案402。通常通过经过显微镜光学链聚焦空间相干激 光并且并入扫描元件来生成线扫描激励图案404。通常通过在共焦结构中经过显微镜光学 链聚焦空间相干激光源来生成斑扫描激励图案406。 在这样的常规DNA定序方法中，通常通过对用如图4A-图4C所示无选择性的激励 图案照射的微粒的光学显微镜成像来进行对微粒光学签名的检测。这一方式的速度由于若 干原因而根本上有限。首先，光学显微镜的视场(FOV)根本上与分辨率有联系，S卩，分辨率 越高，FOV就越小。类似地，光学显微镜的景深(DOF)根本上与分辨率有联系，S卩，分辨率越 高，DOF就越小。由于需要高分辨率光学显微镜以使用常规定序方法来分辨微粒，所以FOV 和DOF相对地小。因而，对微粒基片进行成像需要采集数以百计到数以千计的更小图像，这 些图像共同覆盖载玻片如铺片。在各图像之间，必须相对于显微镜物镜精确地平移和聚焦 基片或光学显微镜，在此期间光学显微镜不能采集序列数据。其次，微粒载玻片的高分辨率 图像非常不足以代表微粒中包含的序列信息。例如，在微粒载玻片的典型高分辨率图像中， 图像中的像素数目极大地超过图像中的微粒数目。然而，假设各微粒可以呈现仅四个光学 签名之一，则各微粒载有仅2比特序列信息。因而，根据常规定序方法，采集了比生成序列 信息所必需的数据多数以千倍计的数据。 因此，需要一种更高效、更快和更便利的核酸定序方法。
技术实现思路
本专利技术的实施例包括一种通过有选择地激励核酸微粒并且使用图像处理算法以 提取微粒的光学签名来对核酸如DNA或者RNA(核糖核酸)进行快速定序的方法。术语核 酸在这里包括DNA和RNA两者。这一方式的一个优点在于它允许相对低分辨率的光学显 微镜对有选择地激励的微粒进行成像，这能够实现用极大视场(FOV)和景深(DOF)进行对 微粒光学签名的检测。这一方式的另一优点在于利用有选择性的激励的微粒的相对低分辨 率图像是序列信息的比利用无选择性的激励的微粒的高分辨率图像更高效的数据表示，这 能够极大地减少定序所需的采集数据的量。 在一个实施例中，一种用于对核酸微粒进行定序的方法包括使用一个或者多个 定序反应物对核酸微粒进行定序反应；在激励图案中有选择地激励核酸微粒；以不足以分 辨个别微粒的分辨率对激励的核酸微粒进行光学成像；以及使用与激励图案有关的信息来 处理激励的核酸微粒的光学图像以确定至少光学签名的存在或者不存在。光学签名的存在或者不存在表明核酸的序列信息。虽然以不足以分辨个别微粒的分辨率获得激励的核酸微 粒的图像，但是以足以分辨个别微粒的分辨率进行对核酸微粒的有选择性的激励。可以使 用相同或者不同反应物来重复定序反应、有选择性的激励和图像处理步骤以完成定序。 在一个实施例中，一种用于核酸微粒的光学激励的装置包括用于生成激光束的激 光器、耦合成接收第一激光束的光纤、耦合到第一光纤并且用于接收经由光纤递送的第一 激光束的干涉图案生成模块，其中干涉图案生成模块将第一激光束分成第二激光束和第三 激光束并且通过第二激光束与第三激光束之间的干涉来生成用于有选择地激励目标的激 励图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于对核酸微粒进行定序的方法，所述方法包括以下步骤：使用一个或者多个定序反应物对所述核酸微粒至少进行定序反应；在激励图案中有选择地激励所述核酸微粒；以不足以分辨个别微粒的分辨率对所述核酸微粒进行光学成像；以及使用与所述激励图案有关的信息来处理所述核酸微粒的所述光学图像以确定至少光学签名的存在或者不存在，所述至少光学签名的存在或者不存在表明所述核酸的序列信息。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-8-28 11/846,049一种用于对核酸微粒进行定序的方法，所述方法包括以下步骤使用一个或者多个定序反应物对所述核酸微粒至少进行定序反应；在激励图案中有选择地激励所述核酸微粒；以不足以分辨个别微粒的分辨率对所述核酸微粒进行光学成像；以及使用与所述激励图案有关的信息来处理所述核酸微粒的所述光学图像以确定至少光学签名的存在或者不存在，所述至少光学签名的存在或者不存在表明所述核酸的序列信息。2. 根据权利要求1所述的方法，其中以足以分辨所述个别微粒的分辨率有选择地激励 所述核酸微粒。3. 根据权利要求1所述的方法，其中通过多个照射光束的干涉来生成所述激励图案。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述多个照射光束经历从所述微粒放置于其上的 基片的全内反射。5. 根据权利要求3所述的方法，其中通过所述多个照射光束的干涉来生成的所述激励 图案产生对其中频率样本分布程度与所述微粒的特征尺寸匹配的频域的采样。6. 根据权利要求3所述的方法，其中通过所述多个照射光束的干涉来生成的所述激励 图案产生频域的直线采样。7. 根据权利要求3所述的方法，其中通过所述多个照射光束的干涉来生成的所述激励 图案产生频域的非直线采样。8. 根据权利要求1所述的方法，还包括 对所述核酸微粒进行另一定序反应； 有选择地激励所述核酸微粒；以不足以分辨所述个别微粒的分辨率对所述核酸微粒进行光学成像；以及 使用与所述激励图案有关的信息来处理所述核酸微粒的所述光学图像以确定另一光学签名的存在或者不存在，所述另一光学签名的存在或者不存在表明所述核酸的不同序列信息。9. 根据权利要求1所述的方法，其中有选择地激励所述核酸微粒包括 在通过所述照射光束的干涉来生成的第一激励图案中有选择地激励所述核酸微粒；以及在通过所述照射光束的不同干涉来生成的与所述第一图案不同的第二激励图案中有 选择地激励所述核酸微粒。10. 根据权利要求9所述的方法，其中调制所述照射光束中的至少一个照射光束的相 位以生成所述照射光束的所述不同干涉。11. 根据权利要求1所述的方法，其中确定至少光学签名的存在或者不存在包括确定 所述微粒中的至少一个微粒表现比其它微粒更亮的或者谱特性与其它微粒不同的光学签 名。12. 根据权利要求1所述的方法，其中处理所述核酸微粒的所述光学图像包括 基于与至少所述激励图案有关的所述信息来生成所述微粒的分辨率比所述光学图像更高的合成图像；将微粒签名标识算法应用于所述合成图像以生成微粒光学签名数据；以及应用碱基调用算法以确定与所述核酸的所述序列信息对应的所述至少光学签名的存 在或者不存在。13. 根据权利要求1所述的方法，还包括针对不同视场重复所述有选择性的激励、光学 成像和图像处理的步骤。14. 根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：SS洪，柳济宽，朴宗范，
申请(专利权)人：光速基因组学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]