本发明专利技术公开了一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法。本发明专利技术提供的菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用；还提供一种酶制剂为将所述的菌提取物、苯甲酸钠溶液、壳聚糖溶液混合得到的酶制剂；还提供一种酶法合成亚硝基血红蛋白的方法。本发明专利技术的实验证明，通过亚硝酸还原酶及辅酶生物合成亚硝基血红蛋白，具有反应条件温和、反应过程容易控制、酶制剂来源产业化可操作性强、亚硝基血红蛋白生产率高等优点，利用该技术可直接生产用于肉制品加中过程中的着色剂——亚硝基血红蛋白，显著降低肉制品中亚硝酸盐的添加量，具有广阔的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酶法合成亚硝基血红蛋白色素的方法。
技术介绍
为了使产品具有理想的色泽、增强抑菌性及延长保存期、赋予产品独特的风味，国 内外均一直采用硝酸盐或亚硝酸盐作为肉制品的腌制剂。但是亚硝酸盐的过多摄入将对人 体产生危害，甚至具有致癌作用，因此，过去数十年来各国研究机构都在积极寻找一种能在 肉类生产中替代亚硝酸盐的化合物。亚硝基血红蛋白(HbNO)即是一种替代亚硝酸盐的无 硝着色剂。HbNO是血红蛋白在一定条件下与来源于亚硝酸盐(或一氧化氮)的亚硝基进行合 成反应的产物，由于亚硝基更易于与肌红蛋白(Mb)生成亚硝基肌红蛋白(MbNO)，故将HbNO 添加到肉制品中，HbNO在一定的条件下分解，迅速释放N0_，与肌红蛋白结合，生成鲜艳的红 色，起发色作用。近年来，国内外学者相继开展了利用动物血液中所含有的血红蛋白合成亚硝基血 红蛋白(HbNO)等新型腌肉色素的研究，并将制得的HbNO作为一种着色剂加入到肉制品中， 从而使肉制品呈现鲜亮的玫瑰红色，有效地降低肉制品中亚硝酸盐残留量，也保持了肉制 品所具有的色泽、风味、防腐抗菌等特性。由此可见，以HbNO作为发色剂代替亚硝酸盐发 色，不仅发色效果同亚硝酸盐相同，而且大大降低了亚硝酸盐的残留。利用天然畜禽血液中的血红蛋白为原料制成色泽鲜红、对热和氧稳定的发色剂， 所应具备的条件为(1)含有只将N02—只还原至N0，且不再继续还原的能力；(2)阻止亚 铁氧化为高铁，提供稳定性高的配位体；(3)应用安全无毒、符合中华人民共和国国家标准 (食品卷)的试剂。目前国内外众多学者对亚硝基血红蛋白的合成进行了深入研究，但是合成亚硝基 血红蛋白主要是以化学法为主，加入抗坏血酸等还原性物质使得生成的亚硝基血红蛋白很 不稳定，反应参数不能有效控制，反应产物的着色稳定性不尽人意。酶法生产HbNO的研究 至今还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用。本专利技术提供了菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用；所述菌的提取物按照如下方法制备得到发酵巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627，破碎菌体，离 心，收集上清，即为含有亚硝酸还原酶的菌的提取物。1-10% (体积百分含量)的接种量接种于液体发酵培养基中，初始pH为5. 0-7. 5。 所述发酵温度为30°C _35°C，所述发酵的时间为20h-30h，摇床转速为100-240r/min，得到 菌悬液所述发酵温度具体为30°C、32°C或35°C ；所述发酵时间具体为20h、25h或30h ；每1L发酵所用培养基按照如下方法配制将10g_15g葡萄糖，1.0g-1.5g牛 肉膏，1. Og-2. 0g蛋白胨，1. 35g-2g磷酸氢二钾，0. 5g-0. 7g磷酸二氢钾，lg_2g氯化钠，0.138g-0. 15g 亚硝酸钠，0. lg-0. 2g MgS04 7H20，0. 01g-0. 02g MnS04 H20，0. 01g-0. 02g CaCl2 2H20和水组成，用水补至1L，调pH为7. 0 ；每1L发酵所用培养基具体按照如下方法配制将10g、12g或15g葡萄糖，1. 0g、1.2g 或 1. 5g 牛肉膏，1. 0g、l. 5g 或 2. 0g 蛋白胨，1. 35g、l. 5g 或 2g 磷酸氢二钾，0. 5g、0. 6g 或0. 7g磷酸二氢钾，lg、l. 5g或2g氯化钠，0. 138g、0. 14g或0. 15g亚硝酸钠，0. lg、0. 15g或 0. 2g MgS04 7H20,0. 01g、0. 015g 或 0. 02g MnS04 H20,0. 01g、0. 015g 或 0. 02g CaCl2 2H20 和水组成，用水补至1L，调pH为7. 0 ；所述破碎菌体的方式为超声破碎，所述超声的功率为200w ；所述超声的次数为90 次；所述超声的方式为间歇10s，超声5s ；所述离心力为26000g，离心时间为15min。本专利技术的另一个目的是提供一种酶制剂。本专利技术提供的酶制剂为将所述的菌提取物、苯甲酸钠溶液、壳聚糖溶液混合得到 的酶制剂；所述酶制剂中，所述的菌提取物、苯甲酸钠、壳聚糖的配比为2200U-6200U 0. 5m g-1. 5mg 0. 5mg-1.5mg;所述的菌提取物、苯甲酸钠、壳聚糖的配比具体为2200U、3700U或 6200U 0. 5mg、lmg 或 1. 5mg 0. 5mg、lmg 或 1. 5mg ；所述苯甲酸钠溶液按照如下方法制备将苯甲酸钠溶解在浓度为50mM、pH值为 6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到苯甲酸钠溶液，所述苯甲酸钠在所述苯甲酸 钠溶液中的浓度为lg/L_3g/L，所述苯甲酸钠在所述苯甲酸钠溶液中的浓度具体为lg/L、 2g/L 或 3g/L ；所述壳聚糖溶液按照如下方法制备将壳聚糖溶解在浓度为50mM、pH值为6. 5的 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中得到壳聚糖溶液，所述壳聚糖在所述壳聚糖溶液中的浓 度为lg/L_3g/L，所述壳聚糖在所述壳聚糖溶液中的浓度具体为lg/L、2g/L或3g/L。本专利技术的第三个目的是提供。本专利技术提供的方法包括如下步骤将血红蛋白溶液、酶制剂、亚硝酸钠溶液、抗坏血酸溶液和磷酸氢二钠_柠檬酸缓 冲液混合，反应，得到亚硝基血红蛋白。所述血红蛋白、酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合 得到的混合液中的配比为(1-2) mg (200-500) U (0. 0625-0. 225) mg (1. 5-5) mg (2. 145-3. 74) mg (0. 654-1. 475) mg ；所述血红蛋白、酶制剂、亚硝酸钠、抗坏血酸、磷酸氢二钠和柠檬酸在混合液中的 配比具体为 lmg 或 2mg 208U、500U 或 200U 0. 0625mg、0. 075mg 或 0. 225mg 5mg、1.5mg 或 3.75mg 3. 74mg、2. 145mg 或 2. 58mg 1. 475mg、0. 95mg 或 0. 654mg ；所述血红蛋白溶液按照如下方法制备将血红蛋白或血红蛋白提取液与磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液混合得到血红蛋白溶液，所述血红蛋白在所述血红蛋白溶液中的浓度为 6g/l-20g/l，所述血红蛋白在所述血红蛋白溶液中的浓度具体为6g/l、10g/l或20g/l ；所述亚硝酸钠溶液按照如下方法制备将亚硝酸钠溶解在磷酸氢二钠_柠檬酸缓 冲液中得到亚硝酸钠溶液，所述亚硝酸钠在所述亚硝酸钠溶液中的浓度为1. 5g/l-9g/l，所 述亚硝酸钠溶液的浓度具体为1. 5g/l、3g/l或9g/l ；所述抗坏血酸溶液按照如下方法制备将抗坏血酸溶解在磷酸氢二钠_柠檬酸缓 冲液中得到抗坏血酸溶液，所述抗坏血酸在所述抗坏血酸溶液中浓度为60g/l-150g/l，所 述抗坏血酸在所述抗坏血酸溶液中的浓度具体为60g/l、120g/l或150g/l ；所述酶制剂的浓度为500U/ml-2000U/ml，具体为 500U/ml、800U/ml 或 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
菌或菌的提取物在制备亚硝基血红蛋白中的应用； 所述菌的提取物按照如下方法制备得到： 发酵巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＰＦ－９０６ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１６２７，破碎菌体，离心，收集上清液，即为含有亚硝酸还原酶的菌的提取物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘萍，罗岩，孙君社，胡锦荣，张京声，张莹，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[]
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