稳定蛋白和多肽的方法技术

修饰且特别是稳定蛋白和多肽的方法，通过该方法将预先确定的氨基酸引入至所述蛋白或多肽的选择位置中以产生一小组突变体。该方法基于以下的前提，即，某些氨基酸在蛋白或多肽的稳定性方面具有关键的作用。然后可以进一步分析生成的突变体的稳定性和／或功能，例如，亲和性。此外，可以组合适当的突变体，以产生进一步优化的蛋白或多肽。另外，提供了被稳定的实例多肽和适当的鉴定和／或分析去稳定或稳定的蛋白或多肽的方法。该方法可用来研究特定氨基酸在蛋白结构和功能中的作用，和用来开发新的或改善的，例如稳定的蛋白和多肽诸如抗体和单可变结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰且特别是，通过该方法将预先确定的氨基酸引入至所 述蛋白或多肽的选择位置中以产生一小组突变体。该方法基于以下的前提，即，某些氨基酸 在蛋白或多肽的稳定性方面具有关键的作用。然后可以进一步分析生成的突变体的稳定 性和/或功能，例如，亲和性。此外，可以组合适当的突变体以产生进一步优化的蛋白或多 肽。另外，提供了被稳定的实例多肽和适当的鉴定和/或分析失稳或稳定的蛋白或多肽的 方法。该方法可用来研究特定氨基酸在蛋白结构和功能中的作用和用来开发新的或改善 的，例如稳定的蛋白和多肽诸如抗体和单可变结构域。随机化诱变或其他用于蛋白稳定的策略受到一些限制。包括在这些限制中的有， 可以产生大量的突变体，在实践中不能从这些突变体中选择将是提供信息的或具有所需特 性的突变体。例如，没有可靠的方式来预测蛋白或多肽中特定氨基酸的置换、缺失或插入是 否将对蛋白/多肽具有局部或整体的效应，并且因此是否有可能产生有用的信息或功能。 即使突变限于蛋白的某些区域，诸如蛋白的活性或结合位点处的区域或其周围，潜在突变 的数目可以是非常大的，使得难以或不可能以合理的方式鉴定和评价产生的这些突变。例 如，单氨基酸位点被所有其他的天然存在的氨基酸置换产生19种不同的蛋白变异体。如果 几个位点一次被置换，则变异体的数目指数性地增加。对于在蛋白的10个氨基酸位点用所 有氨基酸的置换，产生蛋白的19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19或6.1 χ IO12个 变异体，有用的突变体必须从其中选择。由此得出结论，为了有效地在蛋白的稳定中利用诱 变，突变的类型和数目必须进行接受一些限制性标准，这些标准使生成的突变蛋白的数目 保持在适于分析的数目。本专利技术涉及一种用于生成新的或稳定的蛋白(或多肽)的选择或诱变的方法，以 及由该方法生成的突变蛋白和特定突变蛋白的文库。诱变的目标蛋白、肽或多肽可以是天 然的、合成的或改造的蛋白、肽或多肽，例如，抗体，单可变结构域诸如纳米抗体或dAbs，包 含一个或多个单可变结构域的多肽或变异体(例如，突变体)。在一个实施方案中，该方法 包括将预先确定的氨基酸引入至蛋白的氨基酸序列的预先规定的氨基酸(或几个氨基酸) 的各个位置和每个位置中。突变体可以是a)单个地生成并且因此被单独地加工和/或评 价，或b)可生成蛋白文库，其含有在一个或多个预先规定的氨基酸位置以及从整体上在每 个位置中具有预先确定的氨基酸的突变蛋白。该方法允许系统地评价特定氨基酸在蛋白， 例如，抗体或单可变结构域的稳定中的作用。本专利技术鉴定出在保存期间生成的蛋白例如抗体或单可变结构域的一些主要变体 是如下的结果i.典型地仅在“可接近的”甲硫氨酸中发生的(多个)氧化作用事件(如果仅有 一个氧化事件则为+16Da变异体)，其中在保存期间氧化作用随着温育温度和时间平行地 增加，ii.如果存在，El的环化作用，导致焦谷氨酸的形成，以及iii.天冬氨酸或天冬酰胺的异构化或脱酰胺作用，例如，在DG，DS, NG或NS基序 中，其中在保存期间异构化作用随着温育温度和时间平行地增加。本专利技术利用此观察结果并且提供了一种便利的方法以集中于这些可能的不稳定 的“来源”并且使用此信息来选择先导候选物，或生成a)进一步被稳定的蛋白、抗体或单可 变结构域的单个突变体，其可通过定向诱变来提供，或b)突变蛋白、抗体或单可变结构域 的文库，其可通过合成编码针对含有预先确定的氨基酸的区域设计的氨基酸序列的所有变 异的寡核苷酸的单一混合物来生成。在本专利技术的实施方案中，通过在合成的各个缩合步骤 中掺入要被诱变的序列(例如，野生型序列)的核苷酸和所述预先确定的氨基酸的密码子 所需的核苷酸而合成此寡核苷酸混合物。在被诱变的序列的核苷酸与所述预先确定的氨基 酸的核苷酸相同时，不加入额外的核苷酸(还参见，例如W09115581)。在本专利技术的具体实施方案中，提供了预先规定的氨基酸来替换所述被鉴定的蛋 白、多肽、抗体或单可变结构域的不稳定“来源”，例如，通过选择性诱变，以及随后对所述蛋 白、多肽、抗体、或单可变结构域的例如功能、例如结合特性的分析而进行。此诱变方法可用来生成小的突变蛋白或文库组，其具有用于筛选例如结合亲和力 的实用的大小。该方法可用来研究特定氨基酸在蛋白稳定性和功能中的作用以及开发新的 或稳定的蛋白和多肽诸如酶、抗体、其结合片段或类似物、单链抗体、单可变结构域、纳米抗 体 、dAbs、单结构域抗体和催化抗体。专利技术详述蛋白的研究已经揭示，某些氨基酸在其稳定性和功能中具有关键的作用。例如，似 乎仅有不定数目的氨基酸参与了酶的催化事件或抗体的结合。尽管明确某些氨基酸特别易于去稳定，如果可能，也难以明确地预测氨基酸必须 占用哪个(或哪些)位置以具有此类效应。不幸地是，对蛋白中氨基酸侧链的复杂空间构 型和例如抗体的构架或CDR区内的不同侧链的相互关系的理解不足以进行此类预测。如上 面所指出的，鉴于在甚至很小的蛋白、肽或多肽中可能的变异的庞大数目，随机化诱变对于 研究蛋白稳定性和功能的实用性有限。本专利技术的方法提供了一种系统的和实用的方式用于评价特定氨基酸以及它们在 蛋白的规定区域内的位置对蛋白的稳定性和功能的重要性，以及用于产生有用的，例如稳 定的蛋白。该方法首先假设某些预先确定的氨基酸对于蛋白，例如抗体的特殊稳定性是重 要的(参见,例如 AA Wakankar 等，2007，Biochemistry (生物化学)，46，1534-1544 对天冬 氨酸在抗体的CDR区中的异构化的研究)。使用预先确定的氨基酸的选择，通过将预先确定的氨基酸掺入至蛋白的各个选择 的氨基酸位点而生成要研究的蛋白的突变体文库。如在表B-2中所列举的，根据本专利技术所 提议的法则来生成不同的突变体。专业技术人员理解，这是本文所述所有实施方案的普遍方面，即在选择适当的氨 基酸以替换所选择的残基时，可以采用另外的考虑，例如，降低多肽包括纳米抗体或Dabs 的免疫原性。例如，在纳米抗体的情况下，其可以有利地选择用于替换M(或如本文所讨论 的任何其他的残基或基序)的氨基酸，其存在人构架区的相应位置中。对于其他的参考文 献，专业技术人员也可考虑WO 2009/004065和/或WO 2009/004066的教导。突变蛋白的文库包含在被设计用于替换的每个选择的氨基酸处具有预先确定的 氨基酸的单个蛋白。相对于例如通过完全随机突变或例如“预排(walk through)”突变生 成的突变体文库，所述蛋白文库将具有包含具有提高的稳定性并且保留了功能活性的突变体的较高可能性。因此，所需类型的突变浓缩在文库中。这是重要的，因为其允许更快地和 更详细地分析在适当的时间范围内生成的突变体。在另一个实施方案中，预先确定的氨基酸(例如，替换被鉴定的可能具有不稳定 性的氨基酸的其他天然存在的19个氨基酸之一)替换蛋白的DG，DS, NG或NS基序中的 已鉴定的氨基酸，其中所述基序暴露于溶剂，例如，此类已鉴定的氨基酸基序可见于抗体的 CDR中。优选预先确定的氨基酸选自Q，E的组，如果D或N要被替换则优选E，或如果S或 G要被替换则优选T或A。在进一步的实施方案中，预先确定的被替换的氨基酸，例如其他 天然存在的19个氨基酸之一，替本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在适当的生物体中通过用表达载体转化而制备具有改善的稳定性的多肽序列、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包括至少一个单可变结构域，所述表达载体包含能够产生所述多肽的重组基因，所述方法包括以下的步骤：　　ａ）如果存在Ｎ－末端Ｅ（Ｅ１）或Ｎ－末端Ｑ（Ｑ１），则用另一个天然存在的氨基酸替换所述Ｎ－末端Ｅ（Ｅ１）或Ｎ－末端Ｑ（Ｑ１）；和／或　　ｂ）如果存在至少一个易于氧化的Ｍ，用另一个天然存在的氨基酸替换所述至少一个易于氧化的Ｍ；和／或　　ｃ）如果存在至少一个易于异构化的Ｎ或Ｄ，用另一个天然存在的氨基酸替换所述至少一个易于异构化的Ｎ或Ｄ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：让吕克若尼奥，马克约瑟夫劳韦里斯，帕特里克斯坦森斯，
申请(专利权)人：埃博灵克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]