一种定点突变载体及其使用方法技术

本申请提供一种定点突变载体及其使用方法，涉及生物技术制药工业中基因工程领域，载体除多克隆区域，其他位置含有BbsI酶切位点，定点突变是将所述BbsI酶切位点碱基突变，去除BbsI位点，并保持氨基酸不变。本发明专利技术构建多拷贝载体采用Golden gate的方法，将多个拷贝直接一步组装到系统上，节约时间以及省略多次酶切连接繁琐的步骤。本发明专利技术在体外构建多拷贝载体，增加抗菌肽的拷贝数，实现各单元的同时表达，提高表达量。同时采用抗菌肽基因的串联技术，对抗菌肽基因进行串联，在DNA水平上提高抗菌肽的表达量。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及生物技术制药工业中基因工程领域，具体而言，涉及一种定点突变载体及其使用方法。

技术介绍

1、利用大肠杆菌表达抗菌肽是目前较为成熟且常用的表达手段，该手段已在市场中取得了广泛的应用。例如，使用大肠杆菌对复合抗菌肽al32-p113和重组抗菌肽ubi 18-35进行表达，表达量分别为12.1 mg/l和6 mg/l。抗菌肽fowlicidin-3也可在大肠杆菌中以融合表达形式表达：trx-fowlicidin-3a表达量为0.84 mg/ml，trx-fowlicidin-3b表达量为0.71 mg/ml。抗菌肽smap-29也能在大肠杆菌中表达，在对表达条件进行优化后，抗菌肽smap-29表达率占总蛋白的11.35%。

2、但在实际应用中发现，大肠杆菌表达系统没有真核生物所具备的后期的翻译即修饰蛋白的能力，这使得其表达的抗菌肽稳定性差，活性弱。同时，大肠杆菌表达系统在表达过程中容易产生内毒素，这会导致抗菌肽在后期表达过程中容易对宿主造成“自杀现象”。即杀灭本身的宿主菌。

3、酵母作为真核生物，具备单细胞快速生长和易于遗传操作本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种定点突变载体，其特征在于，所述载体除多克隆区域，其他位置含有BbsI酶切位点，所述定点突变是将所述BbsI酶切位点碱基突变，去除BbsI位点，并保持氨基酸不变。

2.根据权利要求1所述的一种定点突变载体，其特征在于，所述定点突变载体是由除多克隆区域，其他位置含有BbsI酶切位点的载体突变获得，将载体除多克隆区域外的BbsI酶切位点中C突变为T，并保持氨基酸不变。

3.根据权利要求2所述的定点突变载体，其特征在于，所述定点突变载体由pAO815、pPIC9K或pPICZα中的任一种定点突变获得。

4.根据权利要求3所述的定点突变载体，其特征在于，...

【技术特征摘要】

1.一种定点突变载体，其特征在于，所述载体除多克隆区域，其他位置含有bbsi酶切位点，所述定点突变是将所述bbsi酶切位点碱基突变，去除bbsi位点，并保持氨基酸不变。

2.根据权利要求1所述的一种定点突变载体，其特征在于，所述定点突变载体是由除多克隆区域，其他位置含有bbsi酶切位点的载体突变获得，将载体除多克隆区域外的bbsi酶切位点中c突变为t，并保持氨基酸不变。

3.根据权利要求2所述的定点突变载体，其特征在于，所述定点突变载体由pao815、ppic9k或ppiczα中的任一种定点突变获得。

4.根据权利要求3所述的定点突变载体，其特征在于，所述定点突变载体由pao815定点突变获得，所述定点突变载体为pao815-3，序列如seq.id.no.2所示。

5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小璟，祁彩燕，苟兴华，刘冬，张仁怀，高婧，邓飞，
申请(专利权)人：长睿生物技术成都有限公司，
类型：发明
国别省市：