利用核酸酶－适配体复合物检测样品中靶核苷酸序列的方法技术

本发明专利技术涉及检测样品中靶核苷酸序列的方法。更具体地说，本发明专利技术涉及利用核酸酶－适配体（ａｐｔａｍｅｒ）复合物检测样品中靶核苷酸序列的方法。本发明专利技术还提供可用于本发明专利技术方法的核酸酶结合适配体、核酸酶－适配体复合物和接头分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测样品中靶核苷酸序列的方法。更具体地说，本专利技术涉及利用核酸 酶-适配体(aptamer)复合物检测样品中靶核苷酸序列的方法。
技术介绍
业已开发了许多检测感兴趣核苷酸序列(本文也称为“靶核苷酸序列”)的分子 技术。在许多其它应用中这些方法已用于，例如，公众健康、食物和水的病原体(GMO)检测、 流行病学研究、转基因生物体(genetically modifiedorganism)的检测、医药、临床诊断、 疾病可疑性诊断、组织分型、血液筛选、法医学、生物武器检测、分子毒理学、基因治疗和DNA 靶向(治疗)，等等。现有的检测靶DNA序列的方法一般涉及一种分子技术或数种分子技术的组合。这 些技术通常分为三类，不严格地定义为序列特异性检测，序列特异性富集和信号扩增。大多数检测技术通过利用互补性探针或寡核苷酸与靶DNA样品中感兴趣序列的 碱基配对而获知其序列特异性。聚合酶链式反应(PCR)和Southern印迹法(Southern blot)这两种最常用的DNA 检测方法差别是它们如何从此点开始而进行下去。PCR方法通过一系列扩增循环富集靶 DNA，通过利用例如颜色、荧光或放射标记的来检测信号。而Southern印迹法虽不包括DNA 富集步骤，但利用了高能32P作信号扩增。这些已广泛使用的技术虽已高度发展，但仍有显 著缺点。PCR需要昂贵的设备，费时和对专业技能的需求高。Southern印迹法常常要采用 有害的放射标记物，要花费多达一周时间才能完成，并且需要大量的底物DNA。检测样品中特异性DNA序列的有效生物传感器也有目前所用技术的一种或多种 缺陷，但基本上不丧失靶特异性或敏感性是合乎要求的。另外，理想地也要求这类技术的资 金输入低(特别是有设备需求的情况下)，专业技能或特定技术培训最少，以及能提供快速 精确的结果。本说明书中提及的任何现有技术，不是和不应被认为或任何形式地提议是承认此 种现有技术构成任何国家中常用一般知识的一部分。专利技术概述本专利技术部分基于检测样品中靶核苷酸序列的方法，其中该方法采用了核酸酶-适配体复合物。因此，本专利技术第一方面，提供了一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包 括提供一种核酸酶_适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了此核酸酶的活性，当样品中存在靶核苷酸序列时即直接或间接地减少或消除适配体对核酸酶活性的抑制；将核酸酶_适配体复合物加入到样品中；检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在靶核苷酸序列。在适配体复合物中核酸酶具体用作指示剂，因为许多核酸酶比其它酶活性高，可 实现较高程度的信号扩增。而且现已有广泛阵列的核酸酶可购得，其中许多酶作用于不同 的核酸底物或特异性核酸序列。这种靶特异性也使本专利技术得以提供“多重”检测方法同时 检测样品中的多种靶序列。在本专利技术的某些实施方式中，所述核酸酶是限制性内切核酸酶。在一实施方式中，本专利技术方法利用适配体与靶核苷酸序列之间的杂交来修饰、减 少或消除核酸酶与适配体之间的结合。因此，在一实施方式中，本专利技术方法包括以下步骤提供一种核酸酶_适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适 配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性，当样品中存在靶核苷酸序列时该适配体能与靶 核苷酸序列杂交从而修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合；将核酸酶_适配体复合物加入到样品中；如果样品中存在靶核苷酸序列，该序列即与适配体杂交；和检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列。在本专利技术上述实施方式中，设计和选择适配体使之包含能结合核酸酶的区域和能 与靶核苷酸序列杂交的区域。然而，在本专利技术另一实施方式中，对设计和选择同时包含核酸 酶结合区和靶核苷酸序列结合区的适配体的必要性可通过使用接头核酸而消除。因此，在另一实施方式中，本专利技术方法包括以下步骤提供一种核酸酶_适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适 配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性；提供一种接头核酸，其包含能与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交的第一部 分，并包含该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时能与适配体杂交的第二部分，其中 适配体与接头核酸第二部分之间的杂交修饰、减少或消除了适配体与核酸酶之间的结合；将核酸酶_适配体复合物加入到样品中；将接头核酸加入到样品中；使接头核酸第一部分与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交；当该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时，使接头核酸第二部分与适配体杂 交；禾口检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列。核酸酶_适配体复合物在本专利技术方法中的使用也使本专利技术方法能够进行多重检 测，即本专利技术也提供同时检测样品中多种靶核苷酸序列的方法。第二方面，本专利技术提供一种筛检某生物体中是否存在靶核苷酸序列的方法，该方 法包括获得该生物体的含核酸样品，及按本专利技术第一方面的方法检测该样品中是否存在 靶核苷酸序列。第三方面，本专利技术提供一种核酸酶结合性适配体，该适配体与核酸酶结合可抑制 核酸酶的活性。第四方面，本专利技术提供一种核酸酶-适配体复合物，其包含与适配体结合的核酸 酶。第五方面，本专利技术包括一种接头核酸，其包含能与靶核苷酸序列杂交的第一部分，并包含该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时能与核酸酶-适配体复合物中的适配 体杂交的第二部分，其中适配体与接头核酸第二部分之间的杂交修饰、减少或消除了核酸 酶_适配体复合物中适配体与核酸酶之间的结合。第六方面，本专利技术提供一种用于实施本专利技术任何一种方法的试剂盒，该试剂盒包 含本专利技术第三方面的一种或多种适配体；本专利技术第四方面的核酸酶-适配体复合物；和/ 或本专利技术第五方面的接头核酸。在本说明书全篇中，除了另作指明的内容外，词语“包含”或其变化词，如“包括”或 “含有”，应理解为包括所述的基本组分、基本组分的整体或组别，但不排除任何其它基本组 分、基本组分的整体或组别。本文中，用序列标识符(SEQ ID NO:)称呼核苷酸和氨基酸序列。SEQ IDNO 数字 与序列表中该序列标识符相对应，如<400>1 (SEQ ID NO 1), <400>2 (SEQ ID NO 2)等等。 表1提供了序列标识符概要，说明书末尾处提供了序列表。表1.序列标识符概要<table>table see original document page 8</column></row><table>示范性实施方式的描述应理解，以下描述目的只是说明具体实施方式，不是将本专利技术限制于所描述的方面。第一方面，本专利技术提供了一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包括提供一种核酸酶_适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适 配体与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性，其中当样品中存在靶核苷酸序列时适配体对核 酸酶活性的抑制被直接或间接地减少或消除；将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；检测该核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列。要检测靶核苷酸序列的“样品”可以是推测含有靶核苷酸序列的任何样品。例如， 此样品可以是生物学样品，包括得自生物体的样品，含一种细胞或多种细胞的样品，血液样 品，血浆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包括：　　提供一种核酸酶－适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了此核酸酶的活性，当样品中存在靶核苷酸序列时即直接或间接地减少或消除适配体对核酸酶活性的抑制；将核酸酶－适配体复合物加入到样品中；　　检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在靶核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】AU 2007-4-5 2007901826一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，该方法包括提供一种核酸酶-适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体与核酸酶的结合抑制了此核酸酶的活性，当样品中存在靶核苷酸序列时即直接或间接地减少或消除适配体对核酸酶活性的抑制；将核酸酶-适配体复合物加入到样品中；检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在靶核苷酸序列。2.如权利要求1所述的方法，其中，样品中存在的靶核苷酸序列可修饰、减少或消除核 酸酶与适配体之间的结合，从而减少或消除适配体对核酸酶活性的抑制。3.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤提供一种核酸酶_适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体 与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性，当样品中存在靶核苷酸序列时该适配体能与靶核苷 酸序列杂交从而修饰、减少或消除核酸酶与适配体之间的结合； 将核酸酶-适配体复合物加入到样品中； 如果样品中存在靶核苷酸序列，该序列即与适配体杂交；和 检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列。4.如权利要求1-3任何一项所述的方法，其中，该方法包括同时检测样品中多种靶核 苷酸序列的反应，该方法包括提供多种核酸酶_适配体复合物，其中至少两种核酸酶_适配 体复合物包含(i)能与不同靶核苷酸序列杂交的适配体；和(ii)其活性能分别检测的不 同核酸酶。5.如权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤提供一种核酸酶_适配体复合物，该复合物包含结合于一适配体的核酸酶，该适配体 与核酸酶的结合抑制了核酸酶的活性；提供一种接头核酸，其包含能与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交的第一部分，并 包含该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时能与适配体杂交的第二部分，其中适配体 与接头核酸第二部分之间的杂交修饰、减少或消除了适配体与核酸酶之间的结合； 将核酸酶-适配体复合物加入到样品中； 将接头核酸加入到样品中；使接头核酸第一部分与样品中可能存在的靶核苷酸序列杂交；当该接头核酸第一部分与靶核苷酸序列杂交时，使接头核酸第二部分与适配体杂交；禾口检测核酸酶的活性，核酸酶活性升高表明样品中存在该靶核苷酸序列。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述接头核酸包含一茎环结构，并且接头第一部分 的至少一部分包含在该茎环结构的环中，接头第二部分的至少一部分包含在该茎环结构的茎干中。7.如权利要求5或6所述的方法，其中，该方法包括同时检测样品中多种靶核苷酸序列 的反应，该方法包括提供多种接头核酸，其中至少两种接头核酸包含能与不同靶核苷酸序列杂交的不同的 第一部分，并且还包含能与不同适配体杂交的不同的第二部分；和提供多种核酸酶_适配体复合物，其中至少两种核酸酶_适配体复合物包含能与不同的接头核酸第二部分优先杂交的适配体，并且包含其活性能分别检测的不同核酸酶。8.如权利要求5或6所述的方法，其中，该方法包括同时检测样品中多种靶核苷酸序列 的方法，该方法包括提供多种接头核酸，其中至少两种接头核酸包含能与不同靶核苷酸序列杂交的不同的 第一部分，但该接头核酸包含能与同一适配体杂交的第二部分；和提供含有能与该接头核酸第二部分杂交的适配体的核酸酶_适配体复合物。9.如权利要求1-8任何一项所述的方法，其中，通过报告核酸被切割的速率或程度来 检测所述核酸酶的活性。10.如权利要求9所述的方法，其中，所述核酸酶是限制性内切核酸酶。11.如权利要求9或10所述的方法，其中，使一种荧光团结合于所述报告核酸，能猝灭 该荧光团荧光的猝灭剂也结合于所述报告核酸，其中当所述报告核酸被核酸酶切断时即减 少或消除了猝灭剂对荧光团的猝灭作用。12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述报告核酸结合有一多肽并且该报告核酸 还结合于一种固定物，当该报告核酸被切断时使该多肽从固定物释放，因而当固定物固定 后，未固定的多肽量可表明核酸酶的活性。13.如权利要求12所述的方法，其中所述的固定物是磁珠，固定物的固定受施加磁场 的影响。14.如附属于权利要求4或权利要求7的权利要求9-13任何一项所述的方法，其中，提 供了多种报告核酸，其至少两种包含有不同限制性内切核酸酶的切割位点。15.如附属于权利要求11的权利要求14所述的方法，其中包含有不同限制性内切核酸 酶切割位点的至少两种报告核酸也包含从猝灭剂释放时能被分别检测的荧光团。16.如附属于权利要求12的权利要求14所述的方法，其中包含有不同限制性内切核酸 酶切割位点的...

【专利技术属性】
技术研发人员：AS米利根，SJ弗莱彻，
申请(专利权)人：来普利澳大利亚控股有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]