【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物制药，具体地，涉及一种长效促红素的制备方法及其应用。
技术介绍
1、促红细胞生成素（促红素，erythropoietin，epo）于1906年被发现，是一种主要由肾脏产生的糖蛋白，分子量约为35kd，是人体内调节红系造血的主要激素，在红系祖细胞的增殖、分化和成熟中起着重要的调控作用。
2、现有技术中，已经可以应用dna重组技术将epo的基因构建到中国仓鼠卵巢细胞（cho细胞）中，形成可以表达重组人促红细胞生成素（rhepo）基因的cho细胞。
3、而在申请人近期的生产及试验中发现，构建后的可表达rhepo的cho细胞株，对外界环境较为敏感，可能会影响到最终epo的表达。
4、有鉴于此，提出本专利技术。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种长效促红素的制备方法及其应用，以解决
技术介绍
中所述的至少一个技术问题。
2、具体的，本申请的第一方面，提供了一种长效促红素的制备方法，包括步骤：
3、细胞活化，将能够表达重组人促红素的cho细胞株复苏；
4、细胞培养，将复苏的cho细胞加入至cho发酵培养基中进行培养，控制温度在36-38℃，ph在6.8-7.2，溶解氧含量40-60%；
5、蛋白纯化，对培养液中的epo进行纯化；
6、其中，所述cho发酵培养基包括基础培养基以及添加剂，所述添加剂包括组合物a，所述组合物a由脂肪酸、卵磷脂组成，并调节脂肪酸浓度为2-6mg/l，卵磷脂
7、采用上述技术方案，通过在cho发酵培养基的添加剂中补入适量的脂肪酸及卵磷脂组分，可以提高cho细胞在反应器培养时的存活率及蛋白表达的稳定性。
8、优选地，所述脂肪酸浓度为2.5-4mg/l，卵磷脂浓度为1.5-2mg/l。
9、优选地，所述脂肪酸由油酸、花生四烯酸、亚麻酸组成，其中，三者的比例为1-2:0.2-1:1。
10、优选地，所述添加剂还包括组合物b，所述组合物b包括组分：
11、aeo-9 100-300mg/l；
12、胰岛素 2-8mg/l；
13、igf-i 5-15mg/l；
14、转铁蛋白 5-8mg/l；
15、乙醇胺 1-5mg/l。
16、更优选地，所述组合物b包括组分：
17、aeo-9 150-200mg/l；
18、胰岛素 4-6mg/l；
19、igf-i 8-12mg/l；
20、转铁蛋白 6-7mg/l；
21、乙醇胺 2-4mg/l。
22、优选地，所述基础培养基包括糖类、hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）、氨基酸、维生素、无机盐。
23、优选地，所述糖类包括：
24、d-葡萄糖、半乳糖、果糖中一种或几种的组合。
25、优选地，所述糖类包括：
26、d-葡萄糖3000-5000mg/l、半乳糖200-300 mg/l、果糖200-300 mg/l。
27、优选地，所述hepes为1000-1500mg/l。
28、优选地，所述氨基酸包括：
29、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中一种或几种的组合。
30、优选地，所述氨基酸包括：
31、甘氨酸20-40 mg/l、丙氨酸60-100 mg/l、异亮氨酸20-50 mg/l、亮氨酸100-200mg/l、精氨酸200-400 mg/l、天冬酰胺10-30 mg/l、天冬氨酸20-50 mg/l、半胱氨酸25-100mg/l、谷氨酸5-20 mg/l、谷氨酰胺100-300 mg/l、组氨酸25-50 mg/l、赖氨酸100-350 mg/l、甲硫氨酸25-50 mg/l、苯丙氨酸15-60 mg/l、脯氨酸2-10 mg/l、丝氨酸5-50 mg/l、苏氨酸50-100 mg/l、色氨酸5-10 mg/l、酪氨酸10-30 mg/l、缬氨酸50-80 mg/l中的一种或几种的组合。
32、优选地，所述维生素包括：
33、维生素c、维生素h、维生素pp、维生素b6、微生素b2、维生素b1、维生素b12、泛酸钙、叶酸、肌醇中一种或几种的组合。
34、优选地，所述维生素包括：
35、维生素c 0.05-0.1 mg/l、维生素h 0.02-0.05 mg/l、维生素pp 0.1-1 mg/l、维生素b6 0.5-2.5 mg/l、微生素b2 0.01-0.08 mg/l、维生素b1 0.5-2 mg/l、维生素b12 0.05-0.2 mg/l、泛酸钙0.2-2 mg/l、叶酸2-10 mg/l、肌醇 0.5-5 mg/l中一种或几种的组合。
36、优选地，所述无机盐包括：
37、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙、硝酸铁、硫酸锌、硒酸钠、偏硅酸钠、硫酸铜、硫酸铬、氯化铝、矾酸铵、醋酸钡、氯化镍、氯化亚锡、氯化锰中一种或几种的组合。
38、优选地，所述添加剂还包括无机盐，所述无机盐包括：
39、氯化钠 2000-3000 mg/l、碳酸氢钠 800-1200 mg/l、磷酸氢二钠 100-300 mg/l、氯化镁 25-100 mg/l、氯化钙 5-10 mg/l、硝酸铁0.25-1.5 mg/l、硫酸锌0.5-2mg/l、硒酸钠0.01-0.1mg/l、偏硅酸钠0.003-0.006mg/l、硫酸铜0.001-0.004mg/l、硫酸铬0.001-0.006mg/l、氯化铝0.001-0.005mg/l、矾酸铵0.001-0.005mg/l、醋酸钡0.001-0.003mg/l、氯化镍0.00005-0.0001mg/l、氯化亚锡0.00005-0.0001mg/l、氯化锰 0.00001-0.00005mg/l中一种或几种的组合。
40、优选地，所述添加剂不包括胆固醇，或所述胆固醇含量不超过0.005mg/l。
41、优选地，在所述细胞培养步骤中，
42、将复苏的cho细胞以接种密度2-4×105个/ml加入至培养基中进行培养。
43、更优选地，在所述细胞培养步骤中，
44、将复苏的cho细胞以接种密度2.5-3×105个/ml加入至培养基中进行培养。
45、优选地，所述细胞培养步骤中，所述温度变动不超过0.5℃/6h。
46、优选地，所述cho细胞为cho-k1。
47、优选地，所述表达载体可以为pqkx2、psv2、pegfp-n1、pcmvp-neo-ban中的一种。更优选地，所述表达载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种长效促红素的制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脂肪酸浓度为2.5-4mg/L，卵磷脂浓度为1.5-2mg/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脂肪酸由油酸、花生四烯酸、亚麻酸组成，其中，三者的比例为1-2:0.2-1:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述添加剂还包括组合物B，所述组合物B包括组分：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述基础培养基包括糖类、HEPES、氨基酸、维生素、无机盐。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述添加剂不包括胆固醇，或所述胆固醇含量不超过0.005mg/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于：将复苏的CHO细胞以接种密度2-4×105个/ml加入至培养基中进行培养。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白纯化包括步骤：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述疏水层析步骤中，包括步骤：
10.一种如权利要求1-9任一项所述长效促红素在治疗贫血症状上的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种长效促红素的制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脂肪酸浓度为2.5-4mg/l，卵磷脂浓度为1.5-2mg/l。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脂肪酸由油酸、花生四烯酸、亚麻酸组成，其中，三者的比例为1-2:0.2-1:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述添加剂还包括组合物b，所述组合物b包括组分：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述基础培养基包括糖类、hepes、氨基酸、维生...
【专利技术属性】
技术研发人员：桑建彬，薛霞，韩明娣，杨宋，
申请(专利权)人：北京四环生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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