长效重组人促红素的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种长效重组人促红素的生产方法，包括如下步骤；将人IgG2的Fc片段基因连接到人促红素基因的3′端，利用脂质体将含有hEPO‑Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；CHO细胞用无血清基质经扩增培养，在培养液中分泌表达rhEPO‑Fc融合蛋白；培养液经过离心，取上清液，调pH值至3.5‑4.0，滤膜过滤除去沉淀物；过滤后含目的蛋白的溶液上rProtein A Beads层析柱进行层析分离，得粗rhEPO‑Fc融合蛋白；粗rhEPO‑Fc融合蛋白洗脱液用分子筛Superdex 200prep grade进行纯化，得精rhEPO‑Fc融合蛋白。这种方法成本低，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
长效重组人促红素的生产方法
本专利技术涉及一种长效重组人促红素的生产方法。
技术介绍
促红素(Erythropoietin，EPO)是一种促进红系造血前体细胞分化、繁殖的细胞因子，是一种糖蛋白激素，分子量约34KD，产生于人的肾及胎儿的肝脏中，早期主要从尿中提取。重组人促红素(rhEPO)是利用基因工程技术，将人的促红素基因转入哺乳动物细胞内，高效表达的能刺激红细胞生产的糖蛋白激素，用于治疗慢性肾功能衰竭和贫血。但是，rhEPO的平均体内半衰期较短，造成患者给药频繁，这对患者和医护人员都产生了负担。因此，开发长效rhEPO就显得很有必要。在延长rhEPO半衰期方面，目前的尝试包括增加EPO分子的糖含量；以及通过化学缀合聚乙二醇等来增加EPO蛋白的分子量，但PEG化可能导致EPO部分的功能和特异性不可预期的改变。而将EPO与人免疫球蛋白(IgG)的Fc片段相结合，具有独特的优点。IgG是人血液中最丰富的蛋白之一，半衰期可达21天。人免疫球蛋白IgG由4个通过二硫键共价连接的多肽组成。通过木瓜蛋白酶来水解IgG分子产生两个Fab片段和一个Fc片段，Fc片段由通过二硫键连接在一起的两个多肽组成。Fc片段包含CH2和CH3结构和铰链区，EPO肽部分直接连接至铰链区，构成rhEPO-Fc融合蛋白。试验证明，rhEPO-Fc融合蛋白的二聚体不仅稳定性好，而且活性更高。在工业化生产中，在分离纯化rhEPO-Fc融合蛋白时，一般采用两步或三步纯化。但是，在纯化过程中，目的蛋白的损失是不可避免的，一般来说纯化步骤越多，纯化后产品纯度越高，目的蛋白得率越低。例如，“rhEPO-Fc融合蛋白的表达、纯化及质量研究”(杨建军等，《中国生物工程杂志》，2007，27(6))采用0.45微米滤膜过滤，用ProteinA柱分离，再用Q-Sepharose离子交换柱分离，随后用Sephacryal200凝胶层析柱纯化，纯度达到98％以上，但得率只有45％以上，其中ProteinA步骤得率85.1％，Q-Sepharose得率83.3％，Sephacryal200得率65.1％。CN105884906A先用MabSelectSuRe亲和层析进行纯化，再用Captoadhere复合型阴离子交换层析，纯度达到98.5％，得率70％。但是，MabSelectSuRe规格200ml价格20000元，Captoadhere规格100ml的价格在10000元以上，其成本对于工业化来说也是较大的负担。因此，在保证同等产品纯度下，如何降低生产成本，是工业化生产企业不得不考虑的问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种长效重组人促红素的生产方法，这种方法能够保证rhEPO-Fc融合蛋白产品纯度达到98％，rhEPO-Fc融合蛋白得率高，而且纯属化需要的材料成本较低。本专利技术采用如下技术方案，其生产步骤包括：(1)将人IgG2的Fc片段基因连接到人促红素基因的3′端，利用脂质体将含有hEPO-Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；CHO细胞用无血清基质经扩增培养，在培养液中分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白；(2)培养液经过离心，取上清液，调pH值至3.5-4.0，上清液变浊，离心或过滤除去沉淀物；(3)除去沉淀物后含目的蛋白的溶液上rProteinABeads层析柱进行层析分离，得粗rhEPO-Fc融合蛋白；(4)粗rhEPO-Fc融合蛋白用分子筛Superdex200prepgrade进行纯化，得精rhEPO-Fc融合蛋白。进一步的，所述步骤(2)中调节pH值的采用盐酸溶液，以尽量减少离子种类，与常用的酸酸和柠檬酸相比，更有利于后续除盐。进一步地，所述步骤(3)为：将步骤(2)过滤后的滤液，用NaOH调节pH值到中性，上rProteinABeads层析柱，柱规格5cm*8cm，然后用5倍柱体积的pH7.0的缓冲液进行洗杂，所用缓冲液为0.15MNaCl-20mMNa2HPO4，然后用10倍柱体积的pH3.0的0.1M甘氨酸洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，用NaOH调节pH值到中性。采用5倍体积缓冲液洗杂，可以减少目的蛋白损失。进一步地，所述步骤(4)上分子筛纯化过程为：分子筛Superdex200prepgrade层析柱先用pH7.0的150mMNaCl缓冲液平衡，再将样品上柱纯化。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术采用rProteinABeads层析和Superdex200prepgrade分子筛，两种介质成本低，能够显著降低材料成本。通过层析分离前降低pH使宿主蛋白、DNA等杂质溶解度降低分离，可减少后续纯化负担；再用rProteinABeads层析柱分离出目的蛋白，分子筛除盐，可使产品纯度在达到98％以上前提下，rhEPO-Fc融合蛋白的总得率达到80％以上，提高了生产效率从而降低了生产成本，适合工业化生产。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以助于理解本
技术实现思路
。实施例1(1)将人IgG2的Fc片段基因连接到人促红素基因的3′端，利用脂质体将含有hEPO-Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；CHO细胞用无血清基质经扩增培养，在培养液中分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白，具体按CN1872881A、“长效人促红细胞生成素融合蛋白及其制备和纯化方法”进行。(2)将步骤(1)得到的细胞培养液，经离心后上清液用1mM的HCl溶液调节pH至3.5，溶液变浊，静置1h，然后用22微米滤膜过滤除去沉淀物和杂质。(3)rProteinABeads层析介质(Solarbio，CAS：R8290)装柱，柱规格5cm*8cm，用5倍柱体积的结合Buffer(0.15MNaC，20mMNa2HPO4，pH7.0)进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用；将步骤(2)经过过滤除杂后的溶液上柱，然后用5倍柱体积的pH7.0的缓冲液进行洗杂，所用的缓冲液为0.15MNaCl-20mMNa2HPO4；再用10倍柱体积pH3.0的0.1M甘氨酸洗脱液进行洗脱，收集粗目的蛋白洗脱液，用NaOH调节pH值到pH7.0。(4)分子筛Superdex200prepgrade(GE，CAS17-1043-01)层析柱先用pH7.0的150mMNaCl缓冲液平衡，将步骤(3)中pH7.0的洗脱液上分子筛层析柱，进行除盐，得rhEPO-Fc融合蛋白原液。实施例2与实施例1不同之处在于步骤(2)中调节pH值为3.8。实施例3与实施例1不同之处在于步骤(2)中调节pH值为4.0。经过检测，实施例1的rhEPO-Fc融合蛋产品，纯度为98.7％，总得率为81.1％；实施例2纯度为98.5％，总得率82.3％；实施例3纯度为98.4％，总得率82.4％。本文中应用了具体个例对专利技术构思进行了详细阐述，以上实施例的说明用于帮助理解本专利技术的核心思想。应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离该专利技术构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长效重组人促红素的生产方法，包括如下步骤；(1)将人IgG2的Fc片段基因连接到人促红素基因的3′端，利用脂质体将含有hEPO‑Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；CHO细胞用无血清基质经扩增培养，在培养液中分泌表达rhEPO‑Fc融合蛋白；(2)培养液经过离心，取上清液，调pH值至3.5‑4.0，上清液变浊，离心或过滤除去沉淀物；(3)除去沉淀物后的含目的蛋白溶液上rProtein A Beads层析柱进行层析分离，得粗rhEPO‑Fc融合蛋白；(4)粗rhEPO‑Fc融合蛋白用分子筛Superdex 200 prep grade进行纯化，得精rhEPO‑Fc融合蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种长效重组人促红素的生产方法，包括如下步骤；(1)将人IgG2的Fc片段基因连接到人促红素基因的3′端，利用脂质体将含有hEPO-Fc重组基因的质粒转染CHO细胞；CHO细胞用无血清基质经扩增培养，在培养液中分泌表达rhEPO-Fc融合蛋白；(2)培养液经过离心，取上清液，调pH值至3.5-4.0，上清液变浊，离心或过滤除去沉淀物；(3)除去沉淀物后的含目的蛋白溶液上rProteinABeads层析柱进行层析分离，得粗rhEPO-Fc融合蛋白；(4)粗rhEPO-Fc融合蛋白用分子筛Superdex200prepgrade进行纯化，得精rhEPO-Fc融合蛋白。2.如权利要求1所述的长效重组人促红素的生产方法，其特征在于：步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：程度胜，桑建彬，薛霞，韩明娣，龙应国，
申请(专利权)人：北京四环生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11