一种有机物提纯技术领域的单体７－乙氧基灵芝酸Ｏ及其单体灵芝酸Ｔ的分离纯化方法，包括：制备干菌体提取液，筛选含有７－乙氧基灵芝酸Ｏ条带的组分，结晶处理，制成提纯晶体；使用反向液相色谱分析灵芝酸晶体的晶体纯度；使用甲醇溶液溶解灵芝酸晶体，并向甲醇溶液中添加盐酸，然后置于酸解反应器内进行酸解处理获得单体灵芝酸粗液，最后经旋转蒸发处理后结晶制得单体灵芝酸Ｔ。本发明专利技术能直接得到纯度超过９８％的灵芝酸Ｔ单体或９５％以上纯度的７－乙氧基灵芝酸Ｏ单体，易于操作，方便推广，可为今后单体灵芝酸相关的药物开发和生产奠定稳固的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种有机物提纯
的方法，具体是一种单体7-乙氧基灵芝酸0 及单体灵芝酸T分离纯化方法。
技术介绍
灵芝作为一种名贵药材，在中国及东南亚地区有着悠久的药用历史。现代医药研究表 明，灵芝酸是灵芝重要的活性成分之一，具有抗癌，抗HIV病毒，抗炎症反应等药理功能 (Acta. Pharmacol. Sin. ，25(11)，1387 1395，2004所示。以往的研究大多是用灵 芝抽提物(也即灵芝酸混合物)来研究其抗癌活性，故难以真正阐明灵芝酸的药理作用机 制。近五年来，随着生物技术相关领域的研究进展，国际上有几个研究小组开始陆续使用 单体灵芝酸来完成MTT等抗肿瘤活性筛选实验，并对其相关的抗癌机制进行了报道，如灵 芝酸D和X等(Molecule & Cell Proteomics，7(5)，949 961，2007; Life Sciences 77 (3)，pp. 252 265所示。现有技术表明，灵芝酸T和Me具有显著的抑制癌细胞生长和 转移的功效(Life Science,80(3)，205 211，2006;Process Chemistry, 44(8)，928 933，2009;CN200510026378. X)。这些研究工作显示了灵芝酸将作为一 种极具潜力的辅助抗癌药物。然而，现行低产率的分离技术极难满足相关实验和开发对单 体灵芝酸的大量需求，因此单体灵芝酸制备工艺的开发将成为今后相关药理研究和药物开 发过程中的关键环节之一。目前国内外尚无报道过大量制备单体灵芝酸的方法及工艺。现阶段对于单体灵芝酸的 制备分离仅限于毫克级水平，主要用于结构分析及体外活性筛选。这些研究中所用各种单 体灵芝酸纯品均是从几公斤甚至几十公斤的灵芝干细胞中，经提取、粗分离、及贵重精密 仪器如制备液相色谱仪，精制分离得到的(Agric. Biol. Chem. ， 51 (4)， 1149 1153， 1987; Chem. Pharm. Bull. ， 50(6)， 837 840， 2002)。这些分离纯化的方 法虽可以得到少量的单体灵芝酸，然而操作流程繁琐复杂(大多需要5步以上的分离步骤 )，回收率低，设备成本投入巨大，故难以成为一种单体灵芝酸的大量制备工艺。随着近 年来对于单体灵芝酸体内药理实验和药品商业开发的不断深入，对于单体灵芝酸的需求量 迅速扩大，市场前景广阔，所以急需一种快速、低成本、高纯度、易于工业化的分离纯化 技术来满足市场对其的需求。常压硅胶柱层析是一种传统的吸附色谱，主要基于由物质的不同极性所造成吸附能力 差异来进行分离纯化。在化合物的制备方面，相比于制备液相，制备薄层色谱，制备高速 逆流色谱技术，常压硅胶柱层析具有操作简单，成本低廉，易于扩大化，相关的工业化应 用成熟等优点，目前，常压硅胶柱层析在工业界广泛应用于化合物制备方面，如化工产品 的分离纯化，天然产物的初步分离等。结晶是一种历史悠久的分离技术，是利用溶质之间溶解度的差别进行分离纯化的一种 扩散分离操作，具有成本低，产品成固态，易于商品化等优点，所以常作为化工，生物制 品的最后一步分离纯化工艺，是氨基酸，有机酸和抗生素生产过程中重要的分离纯化手段 。目前，冷结晶，真空和蒸发结晶是结晶工艺的主要方式，相比而言，由于真空和蒸发结 晶容易在浓縮的过程中富集杂质，并且较高的处理温度也对生物产品的稳定不利。因此， 冷结晶技术作为大规模单体灵芝酸分离纯化的最后一道工艺可能十分合适。酸催化工艺已广泛用于各个化工行业，如生物质的酸化水解，柠檬酸合成，树脂聚合 等多个行业。具有技术成熟，配套设备完善，工艺简单，易于操作等优点，是一项符合大 规模，工业化生产要求的工艺技术。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提供一种单体7-乙氧基灵芝酸0及单体灵芝酸 T分离纯化方法，采用常压硅胶柱层析和冷结晶法对灵芝干细胞的提取液进行分离纯化， 得到的7-乙氧基灵芝酸0精制品，另外通过酸解工艺，可以获得具有优良抗癌活性的单体 灵芝酸T。从而保证了在低成本和高纯度的情况下满足对于单体灵芝酸大量制备的需求， 并亦能满足对于该工艺未来工业化的预期要求。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术涉及单体7-乙氧基灵芝酸0的分离纯化方法，包括以下步骤第一步、使用有机溶剂对灵芝干菌体进行超声波辅助抽提，制成干菌体提取液。所述的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯或乙醇中的一种或其组合；所述的灵芝干菌体是指液体发酵得到的灵芝细胞经烘干处理后得到干燥菌丝体；所述的灵芝细胞的获得方式如下67军军直卫生所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC NO. 5. 75的菌株;上海吴淞中学发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC NO. 5. 110的菌株;日本京大发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNO. 5. 533的菌株；中国贵州发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCCNO. 5. 616的菌株；中科院微生物研究所发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为 CGMCC NO. 5. 644的菌株；中国农业科学院发现的，在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC NO. 5. 653的菌株。所述的超声波辅助抽提是指采用有机溶剂对灵芝干菌体为l: l至l: 300的质量比进行配比后置于超声清洗仪中进行抽提，工作功率为40 160W，设置环境温度为5 6(TC， 抽提时间为5 80min，抽提1 5次。第二步、将干菌体提取液经旋转蒸发处理浓縮至浸膏状，然后将其溶解于乙醚中，用 常压硅胶层析色谱采取湿法上样进行分离纯化处理，制成干菌体分离液，再通过TLC薄层 层析法检测干菌体分离液的灵芝酸组成，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸0条带的组分。所述的旋转蒸发处理是指采用旋转蒸发仪，设置环境温度为5(TC以下进行浓縮蒸发。所述的常压硅胶层析色谱的填充材料为50至400目的硅胶；设置柱径比为l :2至1:50; 流动相为乙醚，配以小于等于40%的石油醚或己烷作为极性调节剂；所述的采取湿法上样是指设置上样量小于等于柱体积的20%;设置流速为全流速的 20% 100%的范围内；柱温小于等于5(TC，同时使用自动馏分收集器收集流出液，单管收 集时间小于等于30min;所述的TLC薄层层析法是指将吸附剂均匀地铺在硅胶板上形成薄层后，将干菌体分 离液点滴在薄层上，然后用展开剂展开，使混合物得以分离，然后检测干菌体分离液的灵 芝酸组成。对比标准品，筛选出含有7-乙氧基灵芝酸0条带的组分，获得纯化后的单体灵 芝酸O;所述的吸附剂为硅胶；所述的硅胶板为254nm荧光薄层硅胶板；所述的展开剂的组分及体积比为甲苯乙酸乙酯乙酸=13: 4: 0.4。 第三步、合并TLC检测中含有7-乙氧基灵芝酸0条带的组分，通过旋转蒸发仪蒸发至干 得到固体粗产品，向固体粗产品中加入有机溶剂得到粗产品溶液，向粗产品溶液中加入 7-乙氧基灵芝酸0碎晶后置于结晶器中进行结晶处理，制成粗提纯晶体，将粗提纯晶体二次结晶处理后可得到95%以上纯度的单体7-乙氧基灵芝酸0。所述的粗产品溶液的浓度为5 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单体７－乙氧基灵芝酸Ｏ的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤： 第一步、使用有机溶剂对灵芝干菌体进行超声波辅助抽提，制成干菌体提取液； 第二步、将干菌体提取液经旋转蒸发处理浓缩至浸膏状，然后将其溶解于乙醚中，用常压硅胶层析色谱采取湿法上样进行分离纯化处理，制成干菌体分离液，再通过ＴＬＣ薄层层析法检测干菌体分离液的灵芝酸组成，筛选出含有７－乙氧基灵芝酸Ｏ条带的组分； 第三步、合并ＴＬＣ检测中含有７－乙氧基灵芝酸Ｏ条带的组分，通过旋转蒸发仪蒸发至干，得到固体粗产品，向固体粗产品中加入有机溶剂得到粗产品溶液，向粗产品溶液中加入７－乙氧基灵芝酸Ｏ碎晶后置于结晶器中进行结晶处理，制成粗提纯晶体，将粗提纯晶体经二次结晶处理后得到单体７－乙氧基灵芝酸Ｏ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钟建江，王家乐，李英波，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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