鲤形目5种珍稀鱼类快速鉴别试剂盒制造技术

一种鲤形目５种珍稀鱼类分子生物学快速鉴别试剂盒，其特征是按以下步骤进行：（１）设计鲤形目鱼类通用引物对；（２）采用通用引物对，对该“目”中的各种鱼的ＤＮＡ样本进行扩增；（３）选出每一种鱼的与其它鱼种有差异的ＤＮＡ片段；（４）为每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；（５）用通用引物对中的一条引物分别与每一种鱼的特异引物配对，构成每一种鱼的“引物对”；（６）分别对每一种鱼的ＤＮＡ样本进行ＰＣＲ扩增；将所得到的扩增产物相混合，作为分类标准物；（７）将通用引物对和每一种鱼的一条特异引物相混合，构成混合引物；（８）采用混合引物，对需要鉴别的鱼类ＤＮＡ样本进行扩增；（９）根据扩增产物的电泳条带与鱼类分类标准物的电泳条带比对，得到鉴别结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鱼类分子生物学鉴别方法。
技术介绍
保护生物多样性，就是保护人类自己。由于水体生态环境的特殊性和大多数水产动物一直是人们捕捉的对象，鱼类生物多样性比陆生动物多样性显得 更为脆弱，承受的压力更大。保护好鱼类种质资源，就是保护人类生存所必须 的水产动物蛋白的生产源泉。鱼类资源是一种可更新的资源，只要利用得当， 就可取之不尽，经久不衰，但如果酷捕滥捕，也可发生资源枯竭或个体变小、质量降低。捕捞并不是一个消极因素，只要捕捞合理，它可使鱼类种群产生最大的生产量，人们可获得最大持续望:。据Nelson(1994)报道，全世界共有鱼类 24618种，占脊推动物种数的一半以上,在动物界中仅次于昆虫。在全世界，水 面占地球表面的71%,其中，海洋占地面总水面的97%，而淡水仅占地面总水面 的1%，但41%的硬骨鱼类正是生活在面积极其有限的淡水水体里 (Cohen，1970)。全世界约有10亿人以鱼类为i要的蛋白质来源，但同农作物 及畜禽类不同的是，目前，人类所消费的鱼类数量的80%以上依然来自天然捕 捞产品。在全世界水产动物，如鱼类中，只有少数种类已用于养殖,极大多数种 类的养殖潜力尚待评估.—，据初步统计，仅中国，由于工农业生产的迅猛发展以 及生活水平提高后对水产品需求的剧增，水域生态系统处于持续增长的压力 之下，处于濒危状态和受到严重威胁的鱼类有97种(9目，24科，80属)(陈灵 芝，1993)。由于鱼类分布范围广泛-地理差异，生态环境的不同，使得各个地区的 种类不同。由于人们的生活水平的提高，对鱼产品的需求猛增，于是产生了 对鱼类的过渡捕捞，乱捕乱捞时有发生，再加上人们为了满足各种需要而对 鱼类生态环境造成的破坏，使许多鱼种濒临灭绝。虽然我们釆取了一些措施， 例如每年设立禁鱼期，发布鱼类保护白皮书，但由于没有强有力的执法队伍，主要是缺乏快速、准确、经济、易亍操作的鱼类鉴别方法(FA0 2000;Hoelzel 2001; Pank etal. 2001; Smith and Benson 2001; Shivji etal. 2002)，所以 远远达不到预期目的。国内外过去常釆用核DNA和线粒体DM限制性长度多 态性、同工酶电泳、RAPD技术进行鱼类鉴别(Martin 1993;Malik et al. 1997;Baker et al. 1998;Palumbi and Cipviano 1998;Heist and Gold 1999;Diozon et al. 2000),上述现有方法具有繁瑣费时、费力、费钱，不 利于操作，可重复性差，误差大等弊端(Callejas et al. 2001; Chapman et al. 2003 )。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耗费时间少、易于实验室操作、方便直观的鱼 类分子生物学快速鉴别试剂盒。本专利技术方法的基本思路是设计并筛选出一对鲤形目核糖体DNA(rDNA) 5. 8SrRM和28SRNA间的转录间隔子特异的引物作为这个目的通用引物，利 用该通用引物扩增出该目下的各种鱼的DNA片段并测序，然后通过对比设计 出各种鱼的特异引物，通过PCR实验筛选出对各种鱼扩增效果好的特异引物， 同时把各种鱼的特异引物扩增出的DM片段作为分类标准物，然后把该目下 各种鱼的特异引物和通用引物进行混合，利用所得混合引物对需鉴别的鱼类 DNA样本进行PCR扩增，并对得到的PCR产物进行琼脂糖电泳，即可根据电 泳条带对5种珍稀鱼类进行快速鉴别分类。具体来说，本专利技术的鲤形目5种鱼类快速鉴别试剂盒鱼是按以下步骤进行(1) 、设计并筛选出 一对特异针对鲤形目鱼类核糖体DNA ( rDM) 5. 8SrRM 和28SRM间的转录间隔子的引物，作为这个目的所有鱼类通用引物对；(2) 、釆用步骤(l)中的通用引物对，对该目中的各种鱼的DNA样本分 别进行PCR扩增，得出该目的各种鱼的PCR扩增产物；(3) 、分别对上一步骤所得到的各种鱼的PCR扩增产物测序，根据测序结 果选出每一种鱼的 一个与其它鱼种有差异的DNA片段；(4) 、在上一步骤所选出的DNA片段的区域内.，为该目，，中的每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；(5) 、用步骤(l)所得到的同一 目鱼类通用引物对中的一条引物分别与该目中的每一种鱼的特异引物配对，构成该目中的每一种鱼的引物对，，;(6) 、使用上一步骤所得到的每一种鱼的引物对，分别对该目中的 每一种鱼的DNA样本进行PCR扩增；将所得到的该目中的各种鱼的PCR扩增产物相混合，作为分类标准物；(7) 、将步骤(1)中所得的通用引物对和步骤(4)中得到的每一种鱼的一条特异引物相混合，构成混合引物；(8) 、釆用上一步骤所得到的混合引物，在PCR反应体系中对需要鉴别的 鱼类DNA样本进行扩增；(9) 、让上一步骤所得到的扩增产物和所述分型标准物在琼脂糖凝胶上进 行电泳，根据需要鉴别的鱼类DNA扩增产物的电泳条带与分型标准物的电泳 条带的对比，得到鉴别结果。在本专利技术的步骤(3)中，要求在对由通用引物扩增出的每种鱼的DNA片段 测序时，要特别准确，否则根据测序结果设计出来的特异引物与目标DNA序 列不吻合，无法进行特异扩增，导致扩增失败。在本专利技术的步骤(4)中，各种鱼特异引物的设计需要考虑以下几个方面的 要素①、它必须是每种类鱼类基因组的特异序列，即它的序列不会与非特 异种鱼类基因组序列相同或互补。②、选取适当的引物长度。大量实验结果 表明，在设计引物时，引物长度是一个非常关键的参数，18~24个碱基构成 的寡核苷酸链是比较优化的引物长度；引物过短，将会导致特异性的降低； 引物过长，扩增退火时被引发的模板太少，在指数扩增期，甚至每一步退火 步骤的小失误都将扩大，以致引起扩增产物的明显减少。③、选取引物中碱 基GC的含量和引物的退火温度Tm。较低的Tm值会导致特异性的丧失，若釆用太高的退火温度，扩增的效率将会非常低同时也会产生非特异扩增；如果 退火温度太低，引物将产生非特异性退火，从而导致非特异性DNA片段的扩 增。本专利技术推荐在设计引物的Tm值时选择6rC，因为在该温度下，复合扩 增中绝大多数的PCR反应都能进行。本专利技术中，每种鱼特异引物扩增出来的DM片段的大小一定要能在琼脂糖凝胶电泳时能肉眼识别片段大小的差异，所以在设计引物时 一 定要考虑PCR扩增产物的长度。在本专利技术的步骤(5)中，釆用了步骤(l)所得到的目的鱼类通用引物对中的一条引物分别与该目中的各种鱼的特异引物配对，进而构成该目 中的各种鱼的引物对。在实际操作时，可以在通用引物对中任选一条引物 与该目中的各种鱼的特异引物配对。在本专利技术中，特别地采用步骤(6)得到分类标准物，这一点极其重要，这 也是本专利技术有别于现有技术的重要区别特征。这是因为，该分类标准物来自 于每种鱼的特异引物的扩增产物，它具有唯一性，即与每一种鱼的特定DNA 内部结构一一对应，从而为鱼种的最后鉴别提供了基础。在本专利技术的步骤(7)中，在将通用引物对和各种鱼的 一条特异引物相混合 而构成混合引物时，可以根据实际需要而采用不同的混合比例。本专利技术推荐 采用大致为l: 0. 5的混合比例，即釆用通用引物对中的每条引物1与各种鱼 的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类分子生物学快速鉴别方法，其特征是按以下步骤进行：　（１）、设计并筛选出一对特异针对鲤形目鱼类的核糖体５．８ＳＲＮＡ和２８ＳＲＮＡ基因间的转录间隔子ＩＴＳ２引物，作为鲤形目鱼类通用引物对；　（２）、采用步骤（１）中的通用引 物对，对该“目”中的各种鱼的ＤＮＡ样本分别进行ＰＣＲ扩增，得出该“目”的各种鱼的ＰＣＲ扩增产物；　（３）、分别对上一步骤所得到的各种鱼的ＰＣＲ扩增产物测序，根据测序结果选出每一种鱼的一个与其它鱼种有差异的ＤＮＡ片段；　（４）、在 上一步骤所选出的ＤＮＡ片段的区域内，为该“目”中的每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；　（５）、用步骤（１）所得到的同一“目”鱼类通用引物对中的一条引物分别与该“目”中的每一种鱼的特异引物配对，构成该“目”中的每一种鱼的“引物对”； 　（６）、使用上一步骤所得到的每一种鱼的“引物对”，分别对该“目”中的每一种鱼的ＤＮＡ样本进行ＰＣＲ扩增；将所得到的该“目”中的各种鱼的ＰＣＲ扩增产物相混合，作为分类标准物；　（７）、将步骤（１）中所得的通用引物对和步骤（４）中 得到的每一种鱼的一条特异引物相混合，构成混合引物；　（８）、采用上一步骤所得到的混合引物，在ＰＣＲ反应体系中对需要鉴别的鱼类ＤＮＡ样本进行扩增；　（９）、让上一步骤所得到的扩增产物和所述分类标准物在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据需要 鉴别的鱼类ＤＮＡ扩增产物的电泳条带与分型标准物的电泳条带的对比，得到鉴别结果。...

【技术特征摘要】
1、一种鱼类分子生物学快速鉴别方法，其特征是按以下步骤进行(1)、设计并筛选出一对特异针对鲤形目鱼类的核糖体5.8SRNA和28SRNA基因间的转录间隔子ITS2引物，作为鲤形目鱼类通用引物对；(2)、采用步骤(1)中的通用引物对，对该“目”中的各种鱼的DNA样本分别进行PCR扩增，得出该“目”的各种鱼的PCR扩增产物；(3)、分别对上一步骤所得到的各种鱼的PCR扩增产物测序，根据测序结果选出每一种鱼的一个与其它鱼种有差异的DNA片段；(4)、在上一步骤所选出的DNA片段的区域内，为该“目”中的每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；(5)、用步骤(1)所得到的同一“目”鱼类通用引物对中的一条引物分...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁万安，杨帆，
申请(专利权)人：袁万安，杨帆，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]