一种提高小麦种子中蛋白质和结合态赖氨酸含量的方法技术

本发明专利技术涉及小麦育种领域，特别涉及通过采用基因工程方法将辣椒高赖氨酸蛋白基因（ｃｆ１ｒ）导入常规小麦并表达，提高小麦种子中总蛋白质和结合态赖氨酸含量；其特征在于包括构建辣椒高赖氨酸蛋白基因（ｃｆ１ｒ）表达载体ｐＡＨＣ２５－Ｃｆ１ｒ；通过基因枪将ｐＡＨＣ２５－Ｃｆ１ｒ导入受体小麦幼胚细胞，对小麦幼胚细胞愈伤诱导、植株再生，获得Ｔ５代转基因纯合株系；检测Ｔ５代转基因纯合株系后代种子中的ｃｆ１ｒ基因表达丰度，及测定种子中蛋白质和结合态赖氨酸的含量，筛选出种子中蛋白质和结合态赖氨酸含量均显著提高的植株；其优点在于：与常规的种质培育方法相比，具有培育周期短、改良效果明显、对重要农艺性状影响小的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及小麦育种领域，通过采用基因工程方法将辣椒高赖氨酸蛋白基因 (cflr)导入常规小麦并表达，提高小麦种子中总蛋白质和结合态赖氨酸含量。
技术介绍
小麦作为全球重要的粮食作物之一，其籽粒制品不仅供给人们热量，而且也是人 们重要的植物蛋白质来源，可以加工成馒头、面条、面包、饼干、糕点等多种食品。然而，由于 小麦种子蛋白质中一种必需氨基酸——赖氨酸的匮乏，影响了其种子蛋白的完全利用。小 麦种子储存蛋白中赖氨酸的平均含量仅在0. 44%左右(段敏等，1997)，而国际粮农组织 (FAO)公布的赖氨酸理想含量为5. 5 %，小麦种子蛋白的赖氨酸含量远低于FAO要求的含量 水平，而如果小麦面粉中赖氨酸的含量增加0.2%，其可利用蛋白质就可增加60%，因此提 高小麦籽粒赖氨酸含量从而改良小麦蛋白质品质具有重要意义。玉米、水稻和小麦等禾谷类作物赖氨酸含量普遍很低，近几十年来，随着分子生物 学与生物化学技术的发展以及禾本科作物遗传转化体系的建立与完善，通过转基因的途径 提高作物种子的赖氨酸含量，目前主要有以下两个方面的进展1.通过调控植物赖氨酸合成与分解代谢途径中关键酶基因的表达来提高植物种 子中游离赖氨酸的含量孟山都技术有限公司通过抑制玉米籽粒中赖氨酸分解代谢途径 起始端的一个关键酶基因——LKR/SDH的表达，增加了转基因玉米种子中游离赖氨酸的含 量，并对转基因玉米种子申请了专利(CN101389212)；而美国分子遗传学研究与发展公司 则通过向玉米等双子叶植物中引入一个对游离L-赖氨酸的反馈抑制具有抗性的二氢吡啶 二羧酸合酶(DHDFS)基因来提高植物中游离L-赖氨酸的水平，并对该种方法申请了专利 (CN10138465)；孟山都技术有限公司又通过向植物中引入一个对游离L-赖氨酸的反馈抑 制具有抗性的DHDFS基因，并同时抑制种子中LKR/SDH基因的表达，从赖氨酸的合成与分解 代谢两方面同时进行调控来增加植物种子中的赖氨酸水平，并对转基因植物种子及DNA构 建载体申请了专利(CN101321873)；北京未名凯拓农业生物技术有限公司将细菌二氢吡啶 二羧酸合酶基因引入水稻，同时抑制水稻LKR/SDH基因的表达，获得了种子中游离赖氨酸 含量比野生型提高了 18倍的转基因水稻，并对该种方法和载体申请了专利(CN1834252)。2.通过向植物中引入富含高赖氨酸的异源基因来提高植物种子中结合态赖氨 酸的含量中国农业大学将从马铃薯基因组中克隆的一个高赖氨酸蛋白基因SBgLR导入 到玉米中，使其在玉米籽粒中特异性表达，增加了玉米种子中的赖氨酸与蛋白质的含量， 并对SBgLR基因与该种提高禾本科作物种子中赖氨酸与蛋白质的含量的方法申请了专利 (CN1317570)。利用天然存在的高赖氨酸蛋白基因进行转基因研究，可以消除从头合成或经人工 改造设计高赖氨酸蛋白基因可能潜在的危险性，增强其在种子中积累的稳定性。目前已克 隆的自然存在的高赖氨酸基因有来自番茄花粉的tsb基因，来自马铃薯的SBgLR基因、 st-901基因和sb401基因，以及来自四棱豆的wblrp基因，这些高赖氨酸基因被转到水稻(吴超等，2008)，玉米(YU JJ等，2004 ；郎志宏等，2004)，小麦(孟超敏等，2004)，生菜(李 兴涛等，2006)等多种植物。本专利技术中的高赖氨酸基因cflr是我们从辣椒中克隆的一个 新基因(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ :GenBank :EU367999)，其所编码的蛋白中赖氨酸 的含量高达21. 2% (孙晓波等，2008)，高于目前已报道的来源于茄科植物马铃薯和番茄 高赖氨酸蛋白GARP、ST2901、SBgLR和TSB(赖氨酸含量分别为18. 6%、17. 8%、18. 9%和 18.0% )，及四棱豆中的高赖氨酸蛋白LYS(赖氨酸含量为10.8% )，是目前已知的赖氨酸 含量最高的天然存在的蛋白。同时cflr基因所编码的蛋白为非花粉特异性表达蛋白，而 且通过与enBank数据库比较，未发现与过敏蛋白和毒蛋白有同源序列，因此将该基因用于 小麦转基因后不会产生容易引起人过敏反应的蛋白，从而可以提高转基因小麦的食用安全 性。本专利技术采用基因工程方法将cflr基因导入普通小麦并表达，较大幅度提高了小麦种子 中总蛋白质和结合态赖氨酸含量。参考文献1.段敏，温瑞云，李岚，等.陕西小麦品种资源品质鉴定初步研究.陕西农业科 Ψ, 1997(3) 27-28.2.吴超，傅亚萍等，转高赖氨酸蛋白基因脆茎水稻的收获指数及秸秆赖氨酸含量 的研究.浙江农业学报，2008，20 (4) =225-230.3. YU JJ, PENG P. ZhANG XJ, et al. Seed-specific expres sion of a lysine richprotein sb401gene significantly increases both lysine and total proteincontent in nlaize seeds. Mol Breeding,2004,14(1) :1_7.4.郎志宏，于静娟，朱登云，等.高赖氨酸蛋白基因SBgLR的克隆及其对提高玉米 种子中蛋白质和赖氨酸含量的作用.农业生物技术学报，2004，12 (5) =487-492.5.孟超敏，陈绪清，梁荣奇，等.高赖氨酸含量基因在转基因小麦的表达及其赖氨 酸含量分析.科学通报，2004，49 (19) 1731-1736.6.李兴涛，李霞，张金文.高赖氨酸蛋白基因在转基因生菜中的表达和遗传转化 .应用与环境生物学报，2006，12 (4) 472-475.7.孙晓波，房瑞，于桂红，等.辣椒高赖氨酸蛋白基因cflr全长cDNA的克隆及其 组织表达特征·园艺学报，2008，35 (9) 1310-1316.
技术实现思路
所要解决的技术问题针对小麦种子赖氨酸匮乏，因而影响其籽粒营养价值的问题，提供一种通过基因 工程提高小麦种子中结合态赖氨酸含量和蛋白质的方法。技术方案本专利技术的目的是这样实现的，其特征在于以下步骤a、构建一个辣椒高赖氨酸蛋白基因cflr表达载体pAHC25_cflr ；b、通过基因枪将pAHC25-cflr导入受体小麦幼胚细胞；C、对所述的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株；d、对上述转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株，阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T5转基因纯合株系；e、检测T5代转基因纯合株系后代种子中的cflr基因表达丰度，测定种子中蛋白质和结合态赖氨酸的含量；f、筛选出种子中蛋白质和结合态赖氨酸含量均显著提高的转基因植株；所述的辣椒高赖氨酸蛋白基因cflr表达载体pAHC25_cflr通过以下步骤获得A、构建质粒 PUC18-PCN以含有 Nos 3，序列的 pBI2301 见 Seq No. 4 (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ GenBank :AF234316)为模板，5，-GCCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3‘(含 PstI 酶切 位点)和 5，-GCCAAGCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高小麦种子中蛋白质和结合态赖氨酸含量的方法，其特征在于以下步骤：　　ａ、构建一个辣椒高赖氨酸蛋白基因ｃｆｌｒ表达载体ｐＡＨＣ２５－ｃｆｌｒ；　　ｂ、通过基因枪将ｐＡＨＣ２５－ｃｆｌｒ导入受体小麦幼胚细胞；　　ｃ、对所述的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株；　　ｄ、对上述转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株，阳性转基因植株通过自交和ＰＣＲ筛选，获得Ｔ↓［５］转基因纯合株系；　　ｅ、检测Ｔ↓［５］代转基因纯合株系后代种子中的ｃｆｌｒ基因表达丰度，测定种子中蛋白质和结合态赖氨酸的含量；　　ｆ、筛选出种子中蛋白质和结合态赖氨酸含量均显著提高的转基因植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓波，房瑞，马鸿翔，余桂红，周淼平，张旭，许玲，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]