卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种生产卤醇脱卤酶的基因工程菌，并且通过培养该基因工程菌和发酵工艺，使得卤醇脱卤酶的生产工业化。本发明专利技术还提供了该基因工程菌的应用，由该基因工程菌生产出的卤醇脱卤酶可以应用到邻卤醇脱卤环氧化和环氧化物的开环反应中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物领域，尤其涉及一种卤醇脱卤酶基因突变体，生产该卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌的构建，生产及其应用。
技术介绍
环氧化物被公认为是有机合成中最重要、应用最广泛的合成中间体之一。此类化 合物通过化学合成易于制备，但化学反应立体选择性差，针对手性碳相连的羟基和卣素进 行脱卤环氧化过程中，化学反应一般没有立体选择性，虽然可以在一些化学催化剂的帮助 下进行立体选择性反应，但一般反应条件要求苛刻，结果也不理想。借助卤醇脱卤酶生物催 化剂的使用，可以进行高立体选择性脱卤环氧化，从而得到单一的环氧化物，为下一步合成 奠定坚实的基础，而且其也可以用于拆分不同手性的邻卤醇混合物。同样，环氧化物在开环 反应中可以进行立体选择，其中立体选择性开环反应因产生两个邻近的手性中心，所以是 不对称合成中极为重要的方法之一。目前环氧化物开环过程中使用的亲核试剂主要有含碳 亲核试剂、含硫亲核试剂、含氧亲核试剂、含卣素亲核试剂、和含氮亲核试剂等，化学手性开 环需要添加化学手性催化剂，这些手性催化剂在手性选择上的结果并不理想。借助卤醇脱 卤酶生物催化剂的使用，可以进行高手性选择环氧化物开环反应，开环过程中可以加入亲 核基团如氰基、硝基或者叠氮基等，来制备非常有用的化学中间体，使用这种方法也可以对 环氧化物进行手性拆分。 使用化学催化剂进行的化学合成费用昂贵，而且重金属会对环境带来污染，要求 的反应条件也很苛刻。而使用卤醇脱卤酶生物催化剂进行的生物合成，具有反应条件温和， 立体选择性高，价格相对低廉，对环境没有污染等特点，因此，卣醇脱卣酶生物催化在环氧 化物合成中的应用被大力推崇。 近年来，国内外有许多学者把环氧化物的合成和开环反应的研究重心转移到生物 催化领域中，Jensen完成(Can JMicrobiol， 1957. 3 :151-153) 了 a-卤酸脱卤酶的早期石开 究，并把能使卤族离子从卤代有机化合物上释放出来的酶统称为脱卤酶(dehalogenase)， 人们发现脱卤酶具有很好的立体选择作用。脱卤酶既可以进行环氧化反应，同时又可以可 逆地进行开环反应，反应过程中加入亲核基团，环氧和开环可以同时进行，两步反应后亲核 基团将取代卤素，同时又不改变碳原子的手性。 生物催化反应所要求的反应条件一般比较温和常温、常压、中性或者接近中性 pH。这样对设备性能要求不高，投入资金相对较少，生产过程安全，并方便于工厂管理和员 工的操作。 目前针对卤醇脱卤酶在邻卤醇的脱卤反应，申请人在国内还没有发现用基因工程 的方法来工业化生产卤醇脱卤酶的相关报道。
技术实现思路
因此为了更好地实现卤醇脱卤酶的工业化生产，本专利技术提出的技术方案的目的之 一在于提供一种卤醇脱卤酶突变体基因，并通过筛选得到生产该卤醇脱卤酶突变体的基因 工程菌。 本专利技术的另一个目的在于提供一种卤醇脱卤酶突变体。根据本专利技术的技术方案， 构建基因工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌BL21，MC1061，和JM105中的一种，其载体系统选 自改造后的pGEF或改造后的pBAD，且其包括本专利技术所提供的卤醇脱卤酶突变体基因。 根据本专利技术的另一目的，提供了一种利用该基因工程菌制备卤醇脱卤酶突变体的 方法，包括构建该基因工程菌；筛选得到该基因工程菌；培养该基因工程菌；种子罐发酵该 基因工程菌；以及收集和制备卤醇脱卤酶突变体。 本专利技术的另一个目的在于将由基因工程菌生产出的卤醇脱卤酶突变体应用到邻 卤醇脱卤环氧化和环氧化物的开环中。根据本专利技术提供的该基因工程菌的应用，其中，底物的结构式为 其中可以是选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，芳基和 取代芳基组成的组中的任意一种取代基，&可以是选自由低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯 基，炔基，杂环，芳基，取代芳基和酯基组成的组中的任意一种取代基，X为Cl， Br或I。 其中&、 R2独立地选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，杂芳 基，芳基，取代芳基和酯基组成的组。 本专利技术基因工程菌的保藏信息 —种基因工程菌，名称为大肠杆菌MC1061，属于大肠埃希氏菌，拉丁学名 Escherichia coli MC 1061，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期 2008-6-16，保藏编号CCTCC NO :M208089。具体实施例方式根据本专利技术一个实施例的卤醇脱卤酶基因突变体，其来源于放射形土壤杆菌 (Agrobacterium radiobacter)，通过聚合酶链反应扩增(PCR)方式从放射形土壤杆菌细 胞基因组中得到基因序列，然后对某些位点进行突变，从而获得该目的基因，其基因序列为 SEQID NO. 1 根据本专利技术一个实施例的卤醇脱卤酶突变体的蛋白序列为SEQ ID NO. 2。 根据本专利技术一个实施例的重组载体，包括根据本专利技术实施例的卤醇脱卤基因突变 体，载体可以是改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，具有核苷酸序列SEQ ID N0.3，所述改造后的pBAD，具有核苷酸序列SEQ ID NO. 4，其中pGEF采用乳糖启动子，诱 根据本专利技术提供的该基因工程菌的应用，其中底物的结构式为导剂为IPTG ;pBAD采用阿拉伯糖启动子，诱导剂为L-阿拉伯糖。 根据本专利技术一个实施例的生产卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌具有包括卤醇脱 卣酶(halohydrin dehalogenase)基因突变体的重组载体。 具体地，本专利技术的基因工程菌为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏 编号为CCTCC NO :M208089的基因工程菌。 根据本专利技术的一个实施例的基因工程菌发酵工艺，包括以下步骤 A)将根据本专利技术实施例的菌株进行摇瓶发酵； B)种子罐发酵；以及 C)商品罐发酵。 根据本专利技术一个实施例的制备卤醇脱卤酶突变体的方法，包括以下步骤 A)将根据本专利技术实施例的菌株进行摇瓶发酵； B)种子罐发酵； C)商品罐发酵；以及 D)将商品罐发酵所获得的菌体进行处理，获得液态卤醇脱卤酶突变体。 根据本专利技术实施例的制备卤醇脱卤酶突变体的方法可以进一步包括 E)将获得的液态卤醇脱卤酶突变体进行干燥，以获得固态卤醇脱卤酶突变体。 下面对本专利技术的各个步骤进行详细描述。 —、基因工程菌构建过程 1.放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)AD1基因组DNA的抽提 1) 5ml LB培养基细菌过夜培养，取1. 5ml培养物离心12000rpm/3min ; 2)将离心得到的沉淀物用567 ii 1 TE缓冲液(10mM Tris. HCl， pH8. 0 ;lmM EDTA) 溶解，加入30iU 10X的SDS和3iU 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，37摄氏度温育lh ; 3)加入100 ill的5M NaCl，充分混匀，再加入80 ii 1CTAB麵C1溶液(10% CTAB、 0. 7M NaCl)，混匀，65摄氏度温育lOmin ; 4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，混匀离心12000rpm/5min。将上清液转 入一个新离心管中； 5)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : l)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卤醇脱卤酶突变体基因，其包括序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１。

【技术特征摘要】
一种卤醇脱卤酶突变体基因，其包括序列SEQ ID NO.1。2. —种由权利要求l所述的基因编码的卤醇脱卤酶突变体，其具有序列SEQ ID NO. 2。3. —种生产权利要求2所述的卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌，其特征在于所述基因 工程菌中包含权利要求1所述的突变体基因。4. 根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主细胞选自 大肠杆菌BL21，MC 1061，和JM105中的一种。5. 根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的载体系统选自 改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，其具有核苷酸序列SEQ ID NO. 3 ;所 述改造后的pBAD，其具有核苷酸序列SEQ ID NO. 4。6. —种利用权利要求3所述的基因工程菌制备卤醇脱卤酶突变体的方法，其特征在于 包括以下步骤(a) 构建所述基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，载体系统以及卤醇脱卤酶突 变体基因；(b) 筛选得到所述基因工程菌；(c) 培养所述基因工程菌；(d) 种子罐发酵所述基因工程菌；以及(e) 收集和制备卤醇脱卤酶突变体。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌BL21， MC 1061，和 JM105中的一种。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞学锋，李知洪，余明华，姚鹃，余华顺，杨海珍，熊茂盛，石雨，
申请(专利权)人：安琪酵母股份有限公司，
类型：发明
国别省市：42[中国|湖北]