本发明专利技术涉及生物学检测领域，具体公开了一种通过特异引物探针鉴定mi RNA的方法及mi RNA提取试剂盒；本发明专利技术经过系统研究、并反复使用不同样本验证得出最有效的生物标志物组合mi RNAs，提出mi R‑17、mi R‑24、mi R‑25、mi R‑155作为变异组织的诊断生物标志物，为早期生物变异体分子诊断与处理提供了理论支撑，建立了一种Taqman探针多重实时荧光定量PCR体系来克服mi RNAs序列短、血清含量低和高度同源性等难以检测的特性，达到便捷快速、高度特异性地检测血清样本中多种靶标mi RNA的目的，提供的方法和试剂盒能够用于早期生物变异组织的筛查与鉴别，具有检出谱系广、灵敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。
1、传统的mirna的检测技术主要包括northern blot印迹法、微阵列、原位杂交(ish)和核酸扩增技术，发展至今，尽管mirna检测技术的开发研究方面已经取得许多进展，但是仍然存在以下的问题亟待解决：
2、1、目前，虽然已经存在多种mirna检测方法，但可商业化且推广至临床的技术主要还是pcr，但是普通的rt-pcr并无法达到实际所要求的高灵敏度、准确性以及特异性，并且面对临床大规模样品，如何实现快速且大批量检测是技术难点；
3、2、通常一个mirna可以同时调控多种功能，单一mirna位点对于变异体诊断存在易漏判误判的问题。因此，需要开发多位点mirna组合用于提高变异体的判断灵敏度和特异性；
4、3、目前经常以血液作为检测样品，进行体外mirna分析。这一般需要从血清中提取和分离mirna，但其中mirna的含量较低，并且容易出现rna降解的情况，因此有必要进一步开发一种可以提供高质量mirna样品的rna提取技术。
>3、一种通过特异引物探针鉴定mirna的方法，具体包括以下步骤：4、s1、筛选血清mirna标志物，根据标志物设置多对特异引物探针，将多对不同的特异引物探针混合在一起组成完整的特异引物探针混合液，使用u6作为内参，将目标mirna与u6在统一体系中进行反应；
5、s2、选取逆转录酶反应液和pcr酶反应液，与特异引物探针混合液组成检测系统；
6、s3、设置100例阳性样本和100例阴性样本，提取样本中mirna；
7、s4、将mirna上机检测，得到每个靶基因的监测ct值，以u6为内参归一化，统计计算靶基因的定量cut-off值，搭建判断模型，对样本进行阴阳性判断。
8、优选的，所述s1中特异引物探针包括下述四组：
9、mir-17：
10、rt,ctcctatggacaagcagggtccgaggtatccatcgcacgcgagggtcgtccataggaga
11、ctcaccg
12、f,ctaacattcaacgctgtcg
13、r,gaggtatccatcgcacg
14、p,ttatgagtctcctatggacgaccc
15、mir-24：
16、rt,ccagcataaccaagcagggtccgaggtatccatcgcacgcatccgagggttatg
17、ctggactgatat
18、f,ttcttgcctactgagctgat
19、r,gggtccgaggtatccat
20、p,tcagtccagcataaccctcg
21、mir-25：
22、rt,cctatcaccgtaagcagggtccgaggtatccatcgcacgcgtggacaacggtga
23、taggcacaaatt
24、f,gttaccctgtagaaccgaat
25、r,gggtccgaggtatccat
26、p,ctgtgcctatcaccgttgtcc
27、mir-155：
28、rt,cctgcttgactaagcagggtccgaggtatccatcgcacgtcggctacagtcaag
29、caggcgaccatg
30、f,ttcctaacagtctacagccat
31、r,gggtccgaggtatccat
32、p,ttcgcctgcttgactgtagc
33、其中，f与r代表正向和反向引物序列，p代表探针序列。
34、一种mirna提取试剂盒，应用于一种通过特异引物探针鉴定mirna的方法，包括：
35、试剂，所述试剂包括20ml裂解液、8ml沉淀液、15ml漂洗液1、11ml漂洗液2和5ml洗脱液；
36、耗材，所述耗材包括50套吸附柱和收集管。
37、优选的，使用步骤包括：
38、s31、采集和处理样本，选用多个样本，每个样本提取500μl血清；
39、s32、mirna提取，采用离心柱法配合mirna提取试剂盒，提取血清样本中的mirna；
40、s33、逆转录，使用mirna 1st strand cdna synthesis kit(stem-loop)，将含有mir-17、mir-24、mir-25和mir-155中任意一个mir系统与u6组合，加入反应试剂配置工作液，工作液总体积为20微升，进行pcr扩增实验；
41、s34、pcr检测，使用rt-pcr-premix ex taqtm(probe qpcr)takara rr390在0.2mlpcr管或rnaase-free 1.5ml ep管中配制体系液吹打混匀，分装至0.1ml 8-strippcr管或384孔板，将cdna单独加时打到管壁上。
42、优选的，所述s33中，工作液包括：4μl5×mirna rt reaction solution(stem-loop)、2μlmirna rt enzyme mix(stem-loop)、0.5μlmirna rt primer、0.5μlu6 rtprimer和少于1μgtotal rna，添加rnase free water至20μl。
43、优选的，所述s33中，pcr扩增实验所用工作液在管中配制吹打混匀，多个样品一同配制再分装，pcr扩增实验使用pcr扩增仪配置工作数据顺序为：首先25℃运行5min，其次42℃运行15min，然后85℃运行5s，最后保持4℃，扩增完成后轻微离心至管底。
44、优选的，所述s34中，体系液配置物料包括：3μlcdna、5μlpremix ex taq、0.2μlu6f primer、0.2μlu6 r primer、0.2μlmirna f primer、0.2μlmirna r primer、0.4μlu6 p和0.4μlmirna p，添加rnase free water至10μl。
45、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
46、(1)本专利技术经过系统研究发现、并反复用不同样本验证得出的最有效的生物标志物组合mirnas，提本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过特异引物探针鉴定miRNA的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种通过特异引物探针鉴定miRNA的方法，其特征在于：所述S1中特异引物探针包括下述四组：
3.一种miRNA提取试剂盒，应用于权利要求1-2任一项所述的一种通过特异引物探针鉴定miRNA的方法，其特征在于，包括：
4.根据权利要求3所述的一种miRNA提取试剂盒，其特征在于，使用步骤包括：
5.根据权利要求4所述的一种miRNA提取试剂盒，其特征在于：所述S33中，工作液包括：4μL5×miRNA RT Reaction Solution(Stem-loop)、2μLmiRNA RT enzyme mix(Stem-loop)、0.5μLMirna RT primer、0.5μLU6 RT primer和少于1μgTotal RNA，添加RNase freewater至20μL。
6.根据权利要求5所述的一种miRNA提取试剂盒，其特征在于：所述S33中，PCR扩增实验所用工作液在管中配制吹打混匀，多个样品一同配制再分装，PCR扩增实验使用PCR扩增仪配置工作数据顺序为：首先25℃运行5min，其次42℃运行15min，然后85℃运行5s，最后保持4℃，扩增完成后轻微离心至管底。
7.根据权利要求6所述的一种miRNA提取试剂盒，其特征在于：所述S34中，体系液配置物料包括：3μLcDNA、5μLPremix ex taq、0.2μLU6 F primer、0.2μLU6 R primer、0.2μLMiRNA F primer、0.2μLMiRNA R primer、0.4μLU6 P和0.4μLMiRNA P，添加RNase freewater至10μL。
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【技术特征摘要】
1.一种通过特异引物探针鉴定mirna的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种通过特异引物探针鉴定mirna的方法，其特征在于：所述s1中特异引物探针包括下述四组：
3.一种mirna提取试剂盒，应用于权利要求1-2任一项所述的一种通过特异引物探针鉴定mirna的方法，其特征在于，包括：
4.根据权利要求3所述的一种mirna提取试剂盒，其特征在于，使用步骤包括：
5.根据权利要求4所述的一种mirna提取试剂盒，其特征在于：所述s33中，工作液包括：4μl5×mirna rt reaction solution(stem-loop)、2μlmirna rt enzyme mix(stem-loop)、0.5μlmirna rt primer、0.5μlu6 rt primer和少于1μgtot...
【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，沈珊珊，李洪祯，盖冬玮，
申请(专利权)人：青岛万物新生生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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