一种小麦试管苗叶片反复再生的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过小麦试管苗叶片的组织培养使小麦试管苗反复再生的方法，属于植物组织培养技术领域，其步骤包括：（１）胚性愈伤组织的诱导；（２）愈伤组织的继代培养；（３）试管苗的获得；（４）试管苗叶片诱导愈伤组织；（５）二次再生苗的诱导；（６）诱导生根；（７）二次再生苗的移栽。本发明专利技术所提供的小麦试管苗幼叶反复再生的方法成功解决了小麦试管苗反复再生难的问题，是国内外首次通过小麦试管苗幼叶建立起小麦试管苗反复再生体系，使运用叶绿体转基因技术获得同质化的叶绿体转基因小麦成为可能。经试验统计：通过使用本方法试管苗叶片诱导愈伤组织的频率及二次再生苗的频率分别达到了９３％和６６％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种小麦试管苗叶片再生的方法，尤其涉及一种通过小麦试管苗叶片的组织培养使小麦试管苗反复再生的方法，属于植物组织培养

技术介绍
小麦(Triticum aestivum L)是我国的重要经济作物，是粮食的主要来源之一。为了改良小麦，目前所进行的小麦转基因研究，都是将目的基因转入细胞核。与细胞核转基因相比，叶绿体转基因具有表达量高、遗传稳定、环境友好等优点。而作为作物遗传改良新方向的叶绿体基因工程并未运用于小麦遗传性状的改良。这是由于小麦等禾谷类粮食作物很难利用绿色的叶组织进行反复再生，严重限制了其叶绿体转基因工作的开展。 国外的叶绿体基因工程应用主要集中在双子叶植物(Daniell et al.2005)，例如烟草、马铃薯、番茄和胡萝卜等。这些植物之所以能够成功获得性状稳定遗传的改良植株，一个最主要原因是最初获得的叶绿体转基因杂合体可以在筛选过程中使绿色叶片或者绿色愈伤组织反复再生，在反复再生和筛选过程中，逐渐淘汰未转化的叶绿体和未转化的细胞，最终获得同质化的转化体——即叶绿体转基因纯合体(Grevich，J. J.2005)。而单子叶的禾谷类作物，如小麦、水稻等正是由于试管苗叶组织反复再生体系的缺乏，因而无法获得叶绿体转基因的纯合体(Sa Mi Lee et al. 2006)，也极大地限制了利用绿色叶片作为受体材料开展叶绿体转基因研究。 自从陈惠民等(1980)首次通过小麦种子苗叶片组织培养获得再生苗以来， Ahuja(1982) 、 Alf inetta (1983) 、 Kopertekh (2003) 、 Chugh(2003)、郝建国(2003)、宣云 (2004)等都通过不同的配方及培养条件获得了叶片诱导的再生植株。但是，他们都是以种 子苗基部做为实验材料获得的再生苗，也就是只进行了一轮的再生。目前国内外尚未见到 有通过胚性愈伤组织分化的试管苗(即再生苗)幼叶反复再生试管苗的报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种小麦试管苗幼叶反复再生的方 法，以解决小麦试管苗反复再生难的问题。 本专利技术所述反复再生体系指可以通过组织培养过程循环获得再生苗的植物组织 培养体系。 本专利技术所述小麦试管苗叶片反复再生方法，步骤包括(l)胚性愈伤组织的诱导 (2)愈伤组织的继代培养(3)试管苗的获得(4)试管苗叶片诱导愈伤组织(5) 二次再生苗 的诱导(6)诱导生根(7) 二次再生苗的移栽；其中 步骤(1)胚性愈伤组织诱导的方法是取开花后14 16天的小麦未成熟麦穗，于 体积比为75%酒精中浸3 8分钟灭菌；然后将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿 中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚；再挑选直径0. 8 1. 2mm的幼胚，盾片向上接种 于愈伤组织诱导培养基I上，25士rC，黑暗培养2 3周；获得胚性愈伤组织；5 步骤(2)所述愈伤组织继代培养的方法是取步骤(1)获得的愈伤组织，先切除其 上由幼胚长出的胚芽，再把愈伤组织转移到胚性愈伤组织继代培养基上，光照强度为55 65iimo1 m—2 s—、光照时间10 14h d—、昼温度25± rC进行昼夜光照周期培养，2 3 周继代一次； 步骤(3)所述试管苗获得的方法是将步骤(2)所述继代一次以上的胚性愈伤组 织转至分化培养基I，光照强度为75 125iimo1 m—2 s—、光照时间14 18h d—、昼温度25士rC进行昼夜光照周期培养，培养2 3周形成丛生试管苗； 步骤(4)所述试管苗叶片诱导愈伤组织的方法是待步骤(3)培养的试管苗长到 2 5cm，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部1 3mm的叶段放至愈伤组织诱导培养基II 上，25士rC条件下暗培养3 4周，在叶段的切口处有3 4mm的愈伤组织团形成； 步骤(5)所述二次再生苗诱导的方法是将步骤(4)中诱导形成的愈伤组织从叶 段上剥离，然后转至分化培养基II上，按步骤(3)所述条件下进行昼夜光照周期培养3 4周，诱导出二次再生的试管苗； 步骤(6)所述诱导生根的方法是将步骤(5)中获得的二次再生苗转至生根培养 基，按步骤(3)所述的培养条件下进行昼夜光照周期培养3 4周，得生根植株； 步骤(7)所述二次再生苗移栽的方法是将步骤(6)中生根的二次再生试管苗转 至20 ± 1 t:温室条件下，打开培养瓶盖，炼苗2 4天后用镊子将苗夹出，用自来水洗去基部 残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，相对湿度控制在50% 60%之间，经4 7天的适应之后，移至大田； 其中所述混合育苗基质的成分以体积比计为营养土 蛭石=3 : l，花盆高度为 15cm，花盆中所放育苗基质厚度为12cm。所述育苗基质购于山东省农业科学研究院。 上述方法各步中采用的培养基及其配方如下(表1): 表1小麦试管苗反复再生方法中各培养基配方 培养基名称配方作用愈伤组织诱 导培养基IMS基本成分+B5维生素+130 170mg/L谷氨酰胺 +180 220mg/L水解酪蛋白+0. 5 2mg/L 2，4-D+6 8g/L琼脂+25 35g/L蔗糖，pH值5. 7 5. 9用于幼胚诱导愈 伤组织胚性愈伤组 织继代培养 基MS基本成分+B5维生素+130 170mg/L谷氨酰胺 +1 2mg/L2，4-D+6 8g/L琼脂+25 35g/L蔗糖，pH值 5. 7 5. 9用于胚性愈伤组 织继代分化培养基IMS基本成分+B5维生素+130 170mg/L谷氨酰胺 +0. 8 1. 2mg/L6-BA+0. 45 0. 55mg/LIAA+5 7g/L琼 脂+15 25g/L蔗糖，pH值5. 6 5. 8用于愈伤组织分 化长苗6<table>table see original document page 7</column></row><table><table>table see original document page 8</column></row><table>留的培养基，移栽到装有混合育苗基质花盆中，保持相对湿度在60%，经6天的适应之后， 移至大田。 本专利技术的技术方案是先通过幼胚诱导胚性愈伤组织，然后通过胚性愈伤组织诱导 分化获得试管苗，再通过试管苗诱导愈伤组织并分化出二次再生苗，最后再把二次再生苗 移栽获得完整植株。 经试验统计试管苗叶片诱导愈伤组织的频率及二次再生苗的频率分别达到 了 93%和66%以上，比之国内外通过小麦种子苗叶片诱导愈伤组织的频率72% (郝建 国 2003)及再生频率11% (宣云 2004)、加％ (郝建国.加03) 、36% (Kopertekh.加03)都有较大提高。 反复再生体系是获得叶绿体转基因纯合体的关键环节，本专利技术所提供的小麦试管 苗幼叶反复再生的方法成功解决了小麦试管苗反复再生难的问题，是国内外首次通过小麦 试管苗幼叶建立小麦试管苗反复再生体系，通过试管苗幼叶诱导愈伤组织并获得了二次再 生苗，使运用叶绿体转基因技术获得同质化的叶绿体转基因小麦成为可能。附图说明 图1幼胚诱导的愈伤组织。图2愈伤组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦试管苗叶片反复再生方法，步骤包括：（１）胚性愈伤组织的诱导（２）愈伤组织的继代培养（３）试管苗的获得（４）试管苗叶片诱导愈伤组织（５）二次再生苗的诱导（６）诱导生根（７）二次再生苗的移栽；其特征在于：步骤（１）胚性愈伤组织诱导的方法是：取开花后１４～１６天的小麦未成熟麦穗，于体积比为７５％酒精中浸３～８分钟灭菌；然后将未成熟麦粒从麦穗上剥下放至无菌培养皿中，腹沟向下将其夹住，用解剖针挑出幼胚；再挑选直径０．８～１．２ｍｍ的幼胚，盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基Ⅰ上，２述分化培养基Ⅱ配方是：ＭＳ基本成分＋Ｂ５维生素＋１３０～１７０ｍｇ／Ｌ谷氨酰胺＋０．４～０．６ｍｇ／ＬＴＤＺ＋０．８～１．２ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．４５～０．５５ｍｇ／ＬＩＡＡ＋５～１５ｍｇ／ＬＡｇＮＯ↓［３］＋０．５～１．５ｍｇ／ＬＴＩＢＡ＋５～７ｇ／Ｌ琼脂＋１５～２５ｇ／Ｌ蔗糖，ｐＨ值５．６～５．８；上述ＭＳ基本成分及Ｂ５维生素为：５±１℃，黑暗培养２～３周；获得胚性愈伤组织；步骤（２）愈伤组织继代培养的方法是：取步骤（１）获得的愈伤组织，先切除其上由幼胚长出的胚芽，再把愈伤组织转移到胚性愈伤组织继代培养基上，光照强度为５５～６５μｍｏｌ.ｍ↑［－２］.ｓ↑［－１］，光照时间１０～１４ｈ.ｄ↑［－１］，昼温度２５±１℃进行昼夜光照周期培养，２～３周继代一次；步骤（３）试管苗获得的方法是：将步骤（２）所述继代一次以上的胚性愈伤组织转至分化培养基Ⅰ，光照强度为７５～１２５μｍｏｌ.ｍ↑［－２］.ｓ↑［－１］，光照时间１４～１８ｈ.ｄ↑［－１］，昼温度２５±１℃进行昼夜光照周期培养，培养２～３周形成丛生试管苗；步骤（４）试管苗叶片诱导愈伤组织的方法是：待步骤（３）培养的试管苗长到２～５ｃｍ，将其从愈伤组织上切下，取其叶基部１～３ｍｍ的叶段放至愈伤组织诱导培养基Ⅱ上，２５±１℃条件下暗培养３～４周，在叶段的切口处有３～４ｍｍ的愈伤组织团形成；步骤（５）二次再生苗诱导的方法是：将步骤（４）中诱导形成的愈伤组织从叶段上剥离，然后转至分化培养基Ⅱ上，光照强度为７５～１２５μｍｏｌ.ｍ↑［－２］.ｓ↑［－１］，光照时间１４～１８ｈ.ｄ↑［－１］，昼温度２５±１℃进行昼夜光照周期培养３～４周，诱导出二次再生的试管苗；步骤（６）诱导生根的方法是：将步骤（５）中获得的二次再生苗转至生根培养基，光照强度为７５～１２５μｍｏｌ.ｍ↑［－２］.ｓ↑［－１］，光照时间１４～１８ｈ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯丙凯，王文超，耿晓霞，胡洪群，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]