血吸虫高灵敏气相压电免疫传感器制备方法与金属银沉积高灵敏气相压电免疫传感检测方法技术

本发明专利技术提供了一种金属银沉积高灵敏气相压电免疫传感技术，并用于检测日本血吸虫免疫传感方法；传感器制备即传感器的组装，由压电石英晶振预处理、抗原固定化、封闭过程组成；抗体免疫传感检测方法包括免疫反应过程和检测过程。本发明专利技术利用气相压电免疫传感技术，结合酶催化金属银沉积效应，使传感器界面的质量响应增大，从而提高传感器的灵敏度，并可实现多个样品同时检测。本发明专利技术提供的基于金属银沉积的高灵敏气相压电免疫传感技术，设备简单、价格低廉，可实现了免疫分子的批量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及临床医学鉴定和检测
，进一步是指血吸虫高灵敏气相压电免疫传感器制备方法与金属银沉积高灵敏气相压电免疫传感检测方法。
技术介绍
近年来，压电免疫传感器在免疫检测领域受到了人们的广泛关注。压电免疫传感 技术是结合石英晶体高灵敏度的压电效应和免疫反应高特异的识别功能一种生物传感技 术，可响应晶体表面质量变化以及溶液体系中密度，黏度，电导，介电常数等多种参数的变 化。该技术具备理想生物传感技术的诸多优点，包括简便、灵敏、快速、响应范围广、仪器廉 价、体积小，易于实现集成化和联机自动化检测等，用于生化分析无需示踪物标记，也不用 严格的样品纯化或分离，可在非扰动样品体系的条件下实时检测目标物质。特别是自20 世纪八十年代压电液相振荡获得成功后，压电传感检测技术引起了人们的广泛关注并得到 了迅猛的发展，已被逐步应用于药物分析、食品检测、环境监测以及临床疾病诊断等多个领 域。压电免疫传感技术的研究为临床诊断提供一个全新的方向，主要分为压电液相免疫传 感器和压电气相免疫传感器。压电气相免疫传感器是在溶液中进行免疫反应，通过气相中 洗涤与干燥后，测量免疫反应前后响应频率的变化，以获得有关待测抗体的浓度、活性等信 息。1972年，Shons等首次将压电气相传感器应用于免疫分析领域。将牛血清白蛋白(BSA) 固定与晶体表面，置入含有牛血清白蛋白抗体的溶液中反应，通过测量前后频率响应，计算 出BSA抗体的活性。Yokoyama等以免疫竞争的方法发展了一种测定三嗪衍生物的压电气相 免疫传感器。他们通过蛋白质标记的抗原与未标记的抗原竞争表面固定的抗体，根据频率 变化与待测抗原浓度成反比例关系进行测量，获得了较好高的灵敏度。Roederer等第一次 实现了压电液相免疫传感器。由于质量效应压电液相免疫传感器通常受晶体表面蛋白质非 特异性吸附的干扰较大，同时其以单分子层形式固定的抗原(抗体)量与活性也十分有限， 检测限往往在微克级或略低，方法的灵敏度有待提高。 为此，Ebersole等开发了两种新型质量放大的压电免疫分析技术一，通过碱性 磷酸酶标记的二抗催化底物5-溴-4-氯-3碘磷酸酯氧化形成二聚物沉积于晶体表面，导 致晶体谐振频率的大幅度变化来放大信号。二，应用辣根过氧化物酶标记的二抗催化溶液 中的I—氧化为12/13—，再利用压电晶体表面锈蚀的PV-Fc膜对I3—专一性纳入，引起晶体谐 振频率显著变化来放大响应频率信号。这类基于酶催化作用的响应信号放大技术，显著降 低了压电传感器分析的检测下限。Willner小组和Pal小组报道了一种辣根过氧化物酶催 化H202氧化-4-氯-1-萘酚产生沉淀的质量放大压电免疫传感器。我们也曾采用等采用辣 根过氧化物酶催化H202氧化-4-氯-1-萘酚氧化的沉淀体系专利技术了一种高灵敏的质量放大 型液相压电免疫传感技术用于日本血吸虫的免疫检测，结果表明该免疫传感技术在灵敏度 上有显著提高。 但是，目前研制的质量放大型压电免疫传感器一般都采用液相检测技术，使用单个检测池，其阵列化和集成化不够高，而且在液相中的稳定性不好，很难实现批量样品的同 时检测。气相压电传感器不需要检测池，多个晶振可以同时进行检测，方便快速，所以可以 实现多个样品同时快速检测，容易实现商业化，而且使用的晶振不需要封闭，所以降低了成 本，装置便宜，操作简便，具备了理想生物传感器所需要的许多特性。近些年，这种压电传感 技术在免疫分析中的应用已引起了广泛的兴趣。1983年Guilbault首先将甲醛脱氢酶固 定在晶体表面用于甲醛的检测。近来压电嗅觉传感器及压电味敏传感器的研究又有了较大 进展，将压电传感器阵列作微型化处理，则可组成与人鼻、人舌相似功能的"人工鼻"、"人工 舌"。但是目前这种气相压电免疫传感技术受其检测灵敏度的限制，在生物医药领域的应用 仍然较少。因此发展高灵敏的气相压电免疫传感检测技术对于拓展其在生物医药领域的应 用是一件非常应用价值的工作。 血吸虫病是一种危害性很大的寄生虫传染病，全球76个国家和地区有血吸虫病 流行，在亚非拉等地区很是猖獗。其中，日本血吸虫分布在亚洲的中国、日本、菲律宾和印度 尼西亚；埃及血吸虫分布在非洲及西亚地区，曼氏血吸虫分布在中南美洲中东和非洲。中 国只流行日本血吸虫病，简称血吸虫病。全世界血吸虫病流行区人口达6亿，有2亿人受感 染，每年死于本病者达百万之多。 现已有一些检测预防血吸虫病的方法应用于临床，例如免疫电泳沉积，酶联免疫 检测，PCR检测法和直接荧光检测等。这些方法均能实现血吸虫的定量检测，但是操作比较 复杂，费时，并且往往需要昂贵的仪器或放射性物质，更重要的是这些方法往往不能很好的 对血吸虫病进行早期诊断。Rao等采用SDS-PAGE电泳获得的曼氏血吸虫病的31/32KDa的 片段(Sm 31/32KDa)作为抗原，采用ELISA检测患者血清中的特异抗体IsG，发现曼氏血吸虫病患者血清中的特异性抗体滴度高于正常对照组，取得预期的效果，但其灵敏度不能满 足一些日本血吸虫病早期患者或者日本血吸虫循环抗原的检测。金标免疫渗滤法以微孔膜作为载体，用胶体金代替酶标记物，省略底物反应步骤，试剂保存稳定，但标记过程很复杂，不利于快速检测。PCR技术虽然具有高度敏感性、特异性、高效性，操作简便、重复性好、易自动化等突出优点，在日本血吸虫病的诊断上确实有着良好的发展前景和应用趋势。但同样也正是由于PCR的敏感性特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。汪世平等报道了一种以磁性颗粒为载体固定日本血吸虫抗原的酶催化荧光免疫分析方法。由于磁性纳米颗粒易于分离富集，且固定化抗原的免疫反应在准均相条件下进行，反应快速，但因在液相中反应，不能实现实时多样检测。因此非常必要开发一种高灵敏、易洗脱、价廉的压电免疫传感检测技术，并建立血吸虫病压电免疫传感诊断方法。 本专利技术基于这样的背景，开发了一种简单快速的高灵敏气相压电免疫传感检测技术，极大地提高了气相压电免疫传感检测技术的检测灵敏度，并实现了对血吸虫早期的在线批量检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，为克服现有气相压电免疫传感检测技术的检测灵敏 度不高以及现有酶催化质量放大液相压电免疫传感检测技术难以实现大批量样品检测的 限制，结合简便快速的气相压电传感技术和酶催化金属银沉积的放大效应，提供一种血吸 虫高灵敏气相压电免疫传感器制备方法与金属银沉积高灵敏气相压电免疫传感检测方法，4压电免疫传感器制备工艺简单、成本低廉，高灵敏气相压电免疫传感检测技术可实现对血 吸虫早期的批量检测。 本专利技术的技术方案之一是，所述血吸虫高灵敏气相压电免疫传感器制备方法的步 骤如下 (1)晶振的预处理石英晶振用洗涤液洗涤三次，得到的干净晶振再用乙醇和去 离子水冲洗，并在氮气下干燥；所述洗涤液系用浓4504与H202配置而成，且浓度为98%的 浓H2S04与H202的体积比为3:1; (2)抗原固定化室温下，将预处理好的晶振浸泡在10mmol/L半胱胺溶液中放置 过夜(10-14小时)，用乙醇冲洗；在自组装了半胱胺的石英晶振上滴加20 重量百分比 浓度为2. 5%的戊二醛溶液，室温下放置1小时，经去离子水清洗吹干后，再将lOii g/mL抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血吸虫高灵敏气相压电免疫传感器制备方法，它的步骤如下：（１）晶振的预处理：石英晶振用洗涤液洗涤三次，得到的干净晶振再用乙醇和去离子水冲洗，并在氮气下干燥；所述洗涤液系用浓Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］与Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］配置而成，且浓度为９８％的浓Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］与Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］的体积比为３∶１；（２）抗原固定化：室温下，将预处理好的晶振浸泡在１０ｍｍｏｌ／Ｌ半胱胺溶液中放置过夜，用乙醇冲洗；在自组装了半胱胺的石英晶振上滴加２０μｌ重量百分比浓度为２．５％的戊二醛溶液，室温下放置１小时，经去离子水清洗吹干后，再将１０μｇ／ｍＬ抗原ＳｊＡｇ３２滴加到晶振上，室温下放置１小时；（３）封闭：将抗原固定化的石英晶振用磷酸盐缓冲盐水清洗后，滴加２０μｌ牛血清白蛋白溶液到石英晶振上，封闭２０分钟，制备得到血吸虫高灵敏气相压电免疫传感器；所述磷酸盐缓冲盐水用０．０１ＭＮａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］和ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］配制而成，ｐＨ７．４；所述牛血清白蛋白溶液为质量比浓度是０．１％的溶液；（４）保存：将制得的所述压电免疫传感器制保存在４℃的冰箱中备用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴朝阳，周瑾艳，申田田，沈国励，俞汝勤，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]