【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞，具体涉及一种脐血多功能干细胞的制备方法及应用。
技术介绍
1、干细胞是具有一定自我更新能力，并在适宜微环境下具有多向分化潜能的原始细胞，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌等多种组织细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,msc)来源于中胚层的非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征，是细胞治疗和组织工程种子细胞的重要来源。间充质干细胞除来源于骨髓、外周血、脂肪、脐带外，人脐血也是间充质干细胞的重要来源。脐血间充质干细胞除上述的分化能力外，甚至具有一定的跨系和跨胚层分化的能力，此外还可支持和促进造血细胞生长，对造血系统重建有非常重要的作用。
2、脐血是脐带及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞，其主要包含造血干细胞和间充质干细胞。脐血来源充足，采集方便，免疫原性较弱，能更大程度上耐受hla配型不符，其间充质干细胞更为原始，扩增能力较骨髓间充质干细胞更强，故脐血干细胞的作用越来越突出，可用于各系统疾病的细胞移植治疗和作为基因治疗的载体。脐血来源的造血干细胞已经用于治疗血液系统疾病，如白血病患者造血系统重建，但是脐血来源的间充质干细胞的应用价值始终没有被挖掘。在目前的脐血库中，存储的自体脐血使用几率较小，而公共脐血库中单份脐血造血干细胞的数量往往不能满足治疗需求，由于以上两方面的原因，95％以上储存的脐血未得到使用，因此脐血间充质干细胞的市场开发价值潜力巨大。
技术实现思路
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2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、本专利技术提供一种脐血多功能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
4、s1.脐带干细胞悬液的制备：取新生儿脐带血，制备成脐血细胞悬液，接种于消毒液中，孵育，培养至细胞生长融合后，加入沉淀剂，离心，收集细胞，洗涤，加入imdm培养基中制备成脐血干细胞悬液；
5、s2.干细胞的体外增殖：向步骤s1制得的脐血干细胞悬液中加入人参皂苷rg1、雌二醇、孕酮，搅拌混合均匀，孵育，离心，收集固体细胞，洗涤，加入体外培养基中，冷冻保存，制得脐血多功能干细胞。
6、作为本专利技术的进一步改进，步骤s1中所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/l，链霉素0.5-1g/l，ph＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量。
7、作为本专利技术的进一步改进，所述孵育的温度为35-38℃，时间为20-30min。
8、作为本专利技术的进一步改进，步骤s1中所述细胞生长至65-75％融合。
9、作为本专利技术的进一步改进，步骤s1中所述沉淀剂为含有5-10wt％羧甲基纤维素钠、2-4wt％fillcoll 1.077、1-2wt％吐温-20的ph＝7.5-8的pbs缓冲液；步骤s1中所述脐带血和沉淀剂的质量比为100:130-150。
10、作为本专利技术的进一步改进，步骤s2中所述脐血干细胞悬液的细胞含量为2-5×105个/ml；脐血干细胞悬液、人参皂苷rg1、雌二醇、孕酮的质量比为100:0.5-1:1-2:0.3-0.7。
11、作为本专利技术的进一步改进，步骤s2中所述体外培养基的配方：甘油10-15g/l、葡萄糖12-15g/l、海藻糖15-20g/l、柠檬酸1-3g/l、蔗糖3-5g/l、维生素a0.5-1g/l，ph＝7.5-8的pbs缓冲液为溶剂。
12、作为本专利技术的进一步改进，具体包括以下步骤：
13、s1.脐带干细胞悬液的制备：取100重量份新生儿脐带血，制备成脐血细胞悬液，接种于消毒液中，35-38℃孵育20-30min，培养至细胞生长至65-75％融合后，加入130-150重量份沉淀剂，离心，收集细胞，洗涤，加入imdm培养基中制备成脐血干细胞悬液，细胞含量为2-5×105个/ml；
14、所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/l，链霉素0.5-1g/l，ph＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量；
15、所述沉淀剂为含有5-10wt％羧甲基纤维素钠、2-4wt％fillcoll 1.077、1-2wt％吐温-20的ph＝7.5-8的pbs缓冲液；
16、s2.干细胞的体外增殖：向100重量份步骤s1制得的脐血干细胞悬液中加入0.5-1重量份人参皂苷rg1、1-2重量份雌二醇、0.3-0.7重量份孕酮，搅拌混合均匀，35-38℃孵育20-30min，离心，收集固体细胞，洗涤，加入体外培养基中，冷冻保存，制得脐血多功能干细胞；
17、所述体外培养基的配方：甘油10-15g/l、葡萄糖12-15g/l、海藻糖15-20g/l、柠檬酸1-3g/l、蔗糖3-5g/l、维生素a 0.5-1g/l，ph＝7.5-8的pbs缓冲液为溶剂。
18、本专利技术进一步保护一种上述的制备方法制得的脐血多功能干细胞。
19、本专利技术进一步保护一种上述的制备方法制得的脐血多功能干细胞在制备治疗白血病的药物中的应用。
20、本专利技术具有如下有益效果：本专利技术制备的脐血多功能干细胞从脐带中分离得到干细胞，通过在培养液中加入人参皂苷rg1、雌二醇、孕酮，其中，人参皂苷rg1通过诱导非内皮细胞促进血管新生，能够促进制得的干细胞分化成多功能干细胞，雌二醇和孕酮不仅能够增强干细胞的自我更新，而且还能促进干细胞向多功能干细胞方向进行不对称自我更新，具有协同增效的作用。
21、本专利技术制备的脐血多功能干细胞具有很高的分化活性，能够分化成多种不同类型的干细胞，对多种疾病均有很好的治疗效果，对括脑瘫、自闭症、糖尿病等各项疾病，涉及循环系统、内分泌系统、神经系统均有很好的治疗作用，具有广阔的应用前景。
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1.一种脐血多功能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/L，链霉素0.5-1g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为35-38℃，时间为20-30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述细胞生长至65-75％融合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述沉淀剂为含有5-10wt％羧甲基纤维素钠、2-4wt％Fillcoll 1.077、1-2wt％吐温-20的pH＝7.5-8的PBS缓冲液；步骤S1中所述脐带血和沉淀剂的质量比为100:130-150。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述脐血干细胞悬液的细胞含量为2-5×105个/mL；脐血干细胞悬液、人参皂苷Rg1、雌二醇、孕酮的质量比为100:0.5-1:1-2:0.3-0.7。
7.根据权利要求1所述的制备方法
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的脐血多功能干细胞。
10.一种如9所述的制备方法制得的脐血多功能干细胞在制备治疗白血病的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种脐血多功能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/l，链霉素0.5-1g/l，ph＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为35-38℃，时间为20-30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述细胞生长至65-75％融合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述沉淀剂为含有5-10wt％羧甲基纤维素钠、2-4wt％fillcoll 1.077、1-2wt％吐温-20的ph＝7.5-8的pbs缓冲液；步骤s1中所述脐带血和沉淀剂的质量比为100:130-150。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：梁信燊，郑佳宜，马欣，
申请(专利权)人：广东龄值生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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