产生软骨和骨的方法技术

本申请涉及体外诱导干细胞分化为软骨细胞祖细胞和软骨细胞的方法。该方法涉及体外经工程改造的软骨和骨及相关生物材料的产生，以及骨和软骨相关疾病和病症的药物筛选和建模方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

本申请涉及体外诱导干细胞分化为软骨细胞祖细胞和软骨细胞的方法。该方法还涉及体外经工程改造的软骨和骨及相关生物材料的产生，以及骨和软骨相关疾病和病症的药物筛选和建模方法。

技术介绍

1、身体的主要结缔组织，例如皮肤、腱、韧带、软骨和骨，提供了发育所需的重要结构和信息框架。结缔组织的大量细胞外基质(extracellular matrix,ecm)是蛋白质、糖蛋白和蛋白聚糖的复杂相互作用网络，提供了支持细胞维持、生长和分化的动态且必需的三维环境。除了提供高度有序的框架外，ecm还介导发往和发自参与诸如发育和修复过程中的细胞分化和迁移等重要生物过程的细胞的信号。

2、在发育中的关节的接合表面处软骨细胞形成了一个独特的关节软骨细胞群，其产生永久性关节软骨。这些关节软骨细胞合成独特的软骨细胞外基质，其所具有为动关节运动过程中出现的反复机械负荷提供回复力所需的特化特性。这些永久性关节软骨细胞产生特征性软骨细胞外成分，例如主要的结构性胶原蛋白ii和聚集蛋白聚糖，它们具有特定的基因表达谱和特定化学计量(stoichiometry)的软骨细胞外基质成分，这为它们本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.生成软骨细胞、软骨细胞样细胞、软骨样组织、软骨或其组合的方法，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过包括i)至iv)的方法获得所述生骨节细胞：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生骨节细胞表达PAX1、SOX9、FOXC2、PAX9、NKX3.2/BAPX1和TWIST1中的任一种。

4.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生骨节细胞衍生自人胚胎干细胞群(hESC)或人诱导多能干细胞群(iPSC)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述iPSC衍生自无饲养层细胞培养物。

6.根据权利要求1-...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.生成软骨细胞、软骨细胞样细胞、软骨样组织、软骨或其组合的方法，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过包括i)至iv)的方法获得所述生骨节细胞：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生骨节细胞表达pax1、sox9、foxc2、pax9、nkx3.2/bapx1和twist1中的任一种。

4.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述生骨节细胞衍生自人胚胎干细胞群(hesc)或人诱导多能干细胞群(ipsc)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述ipsc衍生自无饲养层细胞培养物。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤a)包括在自步骤a)开始起的任何时间将所述生骨节细胞的聚集体转移到轨道培养。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述软骨细胞的三维聚集体表达选自由col11a1、col11a2、col9a1、col9a2、col9a3、matn1和matn3组成的组的一种或更多种另外的基因。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述软骨细胞、软骨细胞样细胞、软骨样组织、软骨或其组合以范围为20:1至5:1、优选约10:1的比例表达胶原蛋白2(col2a1)和acan，且基本上不表达col10a1。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述软骨细胞、软骨细胞样细胞、软骨样组织、软骨或其组合不以大于col2a1水平约0.2％的水平表达胶原蛋白col1a1或col1a2。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用三碘甲状腺原氨酸(t3)培养所述软骨细胞或软骨细胞样细胞的三维聚集体，以产生表达col10a1的肥大软骨细胞群或肥大软骨细胞样细胞群、肥大软骨样组织、肥大软骨或其组合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法包括在自步骤a)第7天起的任何时间将所述生骨节细胞的聚集体转移到轨道培养。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述肥大软骨细胞、肥大软骨细胞样细胞、肥大软骨样组织、肥大软骨或其组合表达col2a1和col10a1。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肥大软骨细胞、肥大软骨细胞样细胞、肥大软骨样组织、肥大软骨或其组合以范围为约1:1至约2.5:1的比例表达col2a1和col10a1。

14.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用tgf-β3培养所述软骨细胞或软骨细胞样细胞的三维聚集体，优选持续至少2周至约7周的时间段，以产生表达prg4的关节软骨细胞群或关节软骨细胞样细胞群、关节软骨样组织、关节软骨或其组合。

15.生成关节(非肥大)软骨细胞或关节软骨细胞样细胞、关节软骨样组织、关节软骨或其组合的方法，所述方法包括：

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述关节软骨细胞或关节软骨细胞样细胞、关节软骨样组织、关节软骨或其组合表达col2a1、acan、prg4，并且任选地表达选自由aspn、cilp和cilp2组成的组的一种或更多种另外的基因。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养持续至少7天的时间段。

18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养持续7-21天的时间段。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养持续约10-17天的时间段。

20.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述培养持续约14天的时间段。

21.根据权利要求15或16所述的方法，其中步骤a)中的所述培养持续约7天的时间段。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中步骤b)中的所述培养持续至少7天的时间段。

23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中步骤b)中的所述培养持续7-21天的时间段。

24.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中步骤b)中的所述培养持续约10-17天的时间段。

25.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中步骤b)中的所述培养持续约14天的时间段。

26.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中步骤b)中的所述培养持续约7天的时间段。

27.根据权利要求15或16或当引用权利要求15或16时的权利要求17-25中任一项所述的方法，其中步骤c)中的所述培养持续约2周至约5周的时间段。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述fgf途径激活剂选自由fgf2、fgf4、fgf9、fgf19、fgf21、fgf3、fgf5、fgf6、fgf8a、fgf16、fgf17、fgf18、fgf20和fgf23组成的组。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述fgf途径激活剂是fgf2。

30.根据权利要求2-29中任一项所述的方法，其中所述tgf-β途径激活剂选自由激活素a、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、ide1/2(ide1(1-[2-[(2-羧基苯基)亚甲基]酰肼]庚酸)、ide2(庚二酸-1-(2-环戊亚基酰肼))和nodal组成的组。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述tgf-β途径激活剂是激活素a。

32.根据权利要求2-31中任一项所述的方法，其中所述wnt途径激活剂选自由chir99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈)、wnt-1、wnt-2、wnt-2b、wnt-3a、wnt-4、wnt-5a、wnt-5b、wnt-6、wnt-7a、wnt-7a/b、wnt-7b、wnt-8a、wnt-8b、wnt-9a、wnt-9b、wnt-10a、wnt-10b、wnt-11、wnt-16b、rspo协同激动剂、氯化锂、tdzd8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)、bio-丙酮肟((2′z,3′e)-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟)、a1070722(1-(7-甲氧基喹啉-4-基)-3-[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]脲)、hly78(4-乙基-5,6-二氢-5-甲基-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-j]菲啶)、cid 11210285盐酸盐(2-氨基-4-(3,4-(亚甲基二氧基)苄基氨基)-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶盐酸盐)、way-316606、(杂)芳基嘧啶、iq1、qs11、sb-216763和dca组成的组。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述wnt途径激活剂是chir99021。

34.根据权利要求2-33中任一项所述的方法，其中所述pi3k途径抑制剂选自由as252424(5-[[5-(4-氟-2-羟基苯基)-2-呋喃基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮)、as 605240(5-(6-喹喔啉基亚甲基)-2,4-噻唑烷-2,4-二酮)、azd 6482((-)-2-[[(1r)-1-[7-甲基-2-(4-吗啉基)-4-氧代-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基]乙基]氨基]苯甲酸)、bag 956(α,α,-二甲基-4-[2-甲基-8-[2-(3-吡啶基)乙炔基]-1h-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-苯乙腈)、czc24832(5-(2-氨基-8-氟[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-n-(1,1-二甲基乙基)-3-吡啶磺胺)、gsk 1059615(5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮)、ku0060648(4-乙基-n-[4-[2-(4-吗啉基)-4-氧代-4h-1-苯并吡喃-8-基]-1-二苯并噻吩基]-1-哌嗪乙酰胺)、ly 294002盐酸盐(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4h-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐)、3-甲基腺嘌呤(3-甲基-3h-嘌呤-6-胺)、pf 04691502(2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮)、pf 05212384(n-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-n′-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲)、pi 103盐酸盐(3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3′,2′:4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚盐酸盐)、pi 828(2-(4-吗啉基)-8-(4-氨基苯基)-4h-1-苯并吡喃-4-酮)、pp121(1-环戊基-3-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺)、槲皮素、tg 100713(3-(2,4-二氨基-6-蝶啶基)-苯酚)、渥曼青霉素、pik90和gdc-0941组成的组。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述pi3k途径抑制剂是pik90。

36.根据权利要求2-35中任一项所述的方法，其中所述tgf-β途径抑制剂选自由a-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺)、d4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、gw 788388(4-[4-[3-(2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-n-(四氢-2h-吡喃-4-基)-苯甲酰胺)、ly 364947(4-[3-(2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-喹啉)、repsox(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基)-1,5-萘啶)、sb431542(4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、sb-505124(2-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1h-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶)、sb 525334(...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·贝特曼，S·拉曼蒂，E·纳克，
申请(专利权)人：默多克儿童研究所，
类型：发明
国别省市：