胃癌遗传检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测胃癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测白细胞介素－１β基因（ＩＬ－１Ｂ）、谷胱甘肽硫转移酶Ｍ１基因（ＧＳＴＭ１）、肿瘤坏死因子－α基因（ＴＮＦ－α）、肿瘤坏死因子－β基因（ＴＮＦ－β）、错配修复酶基因（ｈＭＬＨ１）、５，１０－亚甲基四氢叶酸还原酶基因（ＭＴＨＦＲ）上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量ＰＣＲ常规组件、ＰＣＲ反应组件等。本发明专利技术的试剂盒通过同时检测与胃癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体胃癌遗传风险。

Gastric cancer genetic testing kit

The present invention discloses a kit for detecting the genetic risk of gastric cancer. The kit includes the detection of interleukin 1 beta gene (IL 1B), glutathione S-transferase M1 gene (GSTM1), tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) gene, tumor necrosis factor beta gene (TNF beta), mismatch repair genes (hMLH1, 5). 10 - methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene - specific primers of single nucleotide polymorphism genotype on the specificity and fluorescent probes, fluorescence quantitative PCR, PCR reaction components and other conventional components. The present kit evaluates individual gastric cancer genetic risk by simultaneously detecting genotypes of polymorphic loci closely associated with genetic risk of gastric cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本专利技术涉及一种检测个体胃癌遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与胃癌密切相关的白细胞介素-ie基因(IL-1B)、谷胱甘肽硫转移酶Ml基因(GSTM1)、肿 瘤坏死因子-a基因(TNF-a)、肿瘤坏死因子-p基因(TNF-0)、错配修复酶基因(hMLHl)、 5， 10-亚甲 基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体胃癌遗传易感性。
技术介绍
胃癌是胃上皮的黏膜受化学致癌因素的刺激，在经历胃黏膜基因突变、非典型增生和原位癌这三个阶 段之后而形成的恶性肿瘤，95%的胃恶性肿瘤是腺癌。该病可发病于任何年龄，其中男性的发病率是女性 的1.5至2.5倍，发病的高峰年龄为50至80岁。胃癌早期70%以上毫无症状，中晚期出现上腹部疼痛、 消化道出血、穿孔、幽门梗阻、消瘦、乏力、代谢障碍以及癌肿扩散转移而引起的相应症状。如果胃癌能 早期发现，则癌肿会仅限于胃壁的粘膜层，5年的生存率可达95%。然而，目前很少有胃癌患者在早期被 发现，导致5年生存率在20% 501细胞因子白细胞介素-l(IL-l)是一种重要的炎症介质，它作为免疫反应的激素，是通过内分泌、自分 泌和旁分泌等的相互作用来实现的。IL-1B也是一种很强的酸抑制剂，lmol的IL-1B是lmol质子泵抑制 剂抑酸作用的100倍，是lmol H2受体拮抗剂抑酸作用的6， 000倍。由于其抑酸作用强烈故可导致胃萎缩， 从而增加胃癌发生的危险性。-31C/T是IL-1B启动子区域上的一个C/T多态位点，该多态导致IL-1B蛋白 表达量上升。该位点有三种基因型CC、 CT、 TT，其中TT为胃癌的风险基因型。当携带TT基因型时，HP 感染引起的IL-1B分泌量异常增多，强烈地抑制胃酸分泌作用，使得胃部酸性下降，容易引起胃萎縮，最 后诱发胃癌的发生。谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)是一种可溶性的二聚体同工酶，具有强有力 的催化效应，能催化底物分子亲电子中心与还原型谷胱甘肽的共轭结合，促进底杨代谢转化和排出体外， 是体内生物转化最重要的II相代谢酶之一。基因缺失(Null)是GSTM1常见的多态位点之一，该多态导致 gstm1酶活性显著下降。该位点有三种基因型，+/+、 +/-、 -/-分别代表无等位基因缺失/缺失一个等位基 因/缺失两个等位基因(完全缺失型)，其中完全缺失型(空白基因型)与胃癌的发生有关。当gstm1基因 发生完全缺失时，机体各组织器官无GSTM1表达，因此也无GSTM1的解毒活性，对环境毒素和致癌物质的 敏感性提高，易发生DNA突变和染色体畸变，患胃癌的风险因此显著增加。肿瘤坏死因子(TNF)是体内具 有多种生物活性的重要致炎细胞因子，由细菌性物质刺激免疫细胞产生，具有较强的杀伤肿瘤细胞的作用。 目前已知的TNF分为两种，TNF-a和TNF-e，主要由脂多糖激活的单核、巨噬细胞及淋巴细胞分泌，可以 诱导产生tnf自身及il-1、 il-6等其他细胞因子，增加人类i、 ii类白细胞抗原(hla)表达，促进b、 t 细胞增殖及免疫球蛋白的合成，除突出的抗肿瘤特性外，还有抗病毒、广泛的诱导炎症和免疫调节功能， 从而在自身免疫性疾病、感染性疾病和恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用。TNF-e基因和TNF-a基因 都位于HLA基因簇内，与HLA I类及II类抗原基因相邻，该区域含有高密度的多态位点。TNF-e基因上 研究较多的为第一号内含子内转录起始部位下游第252(+252)位点处G/A单核苷酸多态性，当+252位为G 时，存在限制性内切酶Nco I的酶切位点；当该位点突变为A时，Nco I酶切位点缺失，TNF-P+252A等 位基因可通过调节转录使tnf-a水平特征性增高。该位点三种基因型为gg、 ga、 'Xa，其中ga和aa是风 险基因型，与胃癌患病风险上升有关。当携带有M和AG基因型时，机体内发生炎症时产生的TNF-a水平 明显升高。高水平的TNF-a可以诱导产生TNF-a自身及IL-1、 IL_6、 IL-8、 IFN-y等多种致炎细胞因子， 扩大幽门螺杆菌(HP)感染后炎症反应，同时还能抑制胃酸分泌，增加胃黏膜萎縮的危险性，促进具有遗传 毒性的炎症副产物的聚集而加重胃黏膜的损害及突变的发生率，从而促进胃癌的发生。G-308A位点是TNF-a启动子区域转录起始起点上游第308位点的单核苷酸多态位点，这一位点也是 目前该基因上研究得最多的位点。当-308位为G时，定义为TNF-1,较为常见；当该位为A时，定义为TNF-g， 较为罕见。多数研究认为TNF-2等位基因能通过增强转录而产生更多的TNF-a蛋白，为强转录激活因子， 与疾病得易感性增强有关。该位点有三种基因型M、 AG、 GG,其中AA、 AG是胃癌的风险基因型。当携带有AA和AG基因型时，机体内发生炎症时产生的TNF-a水平明显升高。高水平的TNF-a可以诱导产生 TNF-a自身及IL-l、 IL-6、 IL-8、 IFN-Y等多种致炎细胞因子，扩大幽门螺杆菌感染后炎症反应，同时还 能抑制胃酸分泌，增加胃黏膜萎縮的危险性，促进具有遗传毒性的炎症副产物的聚集而加重胃黏膜的损害 及突变的发生率，从而促进胃癌的发生。DNA修复相关的酶在维持DNA的稳定性中发挥着重要作用，当它们能够正确地判断并修复受损伤的D^A 时，机体就能正常代谢；而若修复酶基因出现了异常，修复功能就会受到影响，对受损伤的DNA就不能修 复或出现错误的修复，导致蛋白表达错误，进而导致肿瘤的发生。DNA损伤修复可分为碱基切除修复、核 苷酸切除修复、DNA错配修复和直接修复等4种修复通路。hMLHl基因第12号外显子上有一个T/A多态， 引起编码蛋白的第384个氨基酸由Val变为Asp。该多态位点可表示为Val384Asp或T1151A，存在 TT、 TA和AA三种基因型，其中M基因型为胃癌的风险基因型。当携带M基因型时，hMLHl蛋白空间构 象可能发生改变，因此其与其他错配修复因子的结合受到影响，机体DNA错配修复能力因此被削弱，胃癌 的患病风险增加。MTHFR是5， 10-'亚甲基四氢叶酸还原酶的编码基因，该酶的主要作用是在叶酸代谢通路中将5, 10-亚甲 基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递通路。MTHFR基因第5号外显子上的一个C/T多态位点 (C677T)突变，导致编码蛋白第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V),使该酶的热稳定性下降，酶活性也 显著下降。该多态位点的基因型有CC、 CT、 TT，其中CT、 TT被确定为风险基因型，与胃癌的患病风险有 关。在摄入的叶酸充足，能够满足正常的细胞增殖的基础上，当携带风险基因型(TT、 CT)时，MTHFR蛋白 耐热性降低，酶活性减弱，不利于5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，从而降低了甲基化供体 的水平，影响了DNA甲基化及DNA损伤修复机制，最终使胃癌发生风险上升。 '
技术实现思路
基于白细胞介素-ie基因(IL-1B)、谷胱甘肽硫转移酶Ml基因(GSTM1)、肿瘤坏死因子-a基因 (TNF-a)、肿瘤坏死因子-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测个体胃癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于：包括同时检测白细胞介素－１β基因（ＩＬ－１Ｂ）上Ｃ－３１Ｔ　ＳＮＰ位点、谷胱甘肽硫转移酶Ｍ１基因（ＧＳＴＭ１）上ＳＮＰ位点、肿瘤坏死因子－α基因（ＴＮＦ－α）上Ｇ－３０８Ａ　ＳＮＰ位点肿瘤坏死因子－β基因（ＴＮＦ－β）上Ａ２５２Ｇ　ＳＮＰ位点、错配修复酶基因（ｈＭＬＨ１）上Ｔ１１５１ＡＳＮＰ位点、５，１０－亚甲基四氢叶酸还原酶基因（ＭＴＨＦＲ）上Ｃ６７７Ｔ　ＳＮＰ位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ混合液、ＭｇＣｌ↓［２］溶液、荧光定量ＰＣＲ反应缓冲液、去离子水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯哲民，邹祖烨，
申请(专利权)人：上海主健生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]