本发明专利技术一种心脏钠通道基因ＳＣＮ５Ａ新突变体及其检测方法属于生物技术领域。本发明专利技术所要解决的技术问题是提供一种ＳＣＮ５Ａ突变体、含有该突变体的质粒、包含该质粒的细胞、突变蛋白及检测该突变的方法。本发明专利技术公开了一种ＳＣＮ５Ａ突变，位于外显子２０、心脏钠通道蛋白１１８０位Ａ变为了Ｖ，该突变是扩张性心脏病的致病原因。本发明专利技术为扩张型心肌病的早期诊断及新的治疗方案提供了一种新方法。
Heart sodium channel gene SCN5A new mutant and detection method thereof
The invention relates to a novel SCN5A mutant of a heart sodium channel gene and a detection method thereof, belonging to the technical field of biology. The technical problem to be solved is to provide a SCN5A mutant, a plasmid containing the mutant, a cell containing the plasmid, a mutant protein, and a method for detecting the mutation. The present invention discloses a SCN5A mutation, located at exon 20 and heart sodium channel protein 1180 bit A, into V, which is the causative factor of dilated heart disease. The present invention provides a new method for early diagnosis and new treatment plan of dilated cardiomyopathy.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体属于一种心脏钠通道基因SCN5A新突变体及其检测方法。
技术介绍
扩张型心肌病是最常见的心肌病之一，以心室腔扩大、心肌收縮功能下降而左心室壁厚 度正常为主要特征，是心力衰竭的第三位原因，是心脏移植的第一位原因。可由冠心病、心肌 炎及系统性疾病引起，但也可为原发性。原发性扩张型心肌病的发病率约40/10万人，其发 病的细胞及分子机制尚不明确。约有30%的病例表现为家族性，提示遗传因素在其发病中的 重要地位。对于扩张型心肌病，目前尚缺乏有效的早期诊断和治疗方法。未行心脏移植的患者中约 有50%在诊断扩张型心肌病后5年内死亡，虽然血管紧张素转换酶抑制剂、e受体阻滞剂等 药物及植入型心律转复除颤器等治疗手段的出现可能会延长该病患者的生存期，但迄今扩张 型心肌病仍是一种死亡率较高的疾病。心脏钠通道基因(SCN5A)位于染色体3p21，其野生型基因组序列已经发表，包括28个 外显子，编码2016个氨基酸的心肌钠通道蛋白，与心肌细胞动作电位的快速去极化有关，既 往发现SCN5A突变可致多种心律失常，如长QT综合征，Brugada综合征及心脏传导障碍等。
技术实现思路
本专利技术的构思是这样的首次公开一个中国人群中导致扩张型心肌病的心脏钠通道基因(SCN5A)的新突变体，以便开发出对扩张型心肌病的早期诊断方法和新的治疗方法。 本专利技术所要解决的技术问题之一是提供一种心脏钠通道基因SCN5A的新的突变体。 本专利技术所要解决的技术问题之二是提供一种检测心脏钠通道基因SCN5A新突变体的方法。本专利技术所要解决的技术问题之三是提供一种新的心脏钠通道SCN5的新的突变蛋白。 因而，本专利技术的技术方案是这样的本专利技术提供了一种心脏钠通道基因SCN5A的新的突变体，其特征在于，如序列表Seq ID No.59的外显子20 (Exon20)的128位的g突变为a。基于上述新突变体，相应地其互补序 列则由c突变成了t。本专利技术还提供了一种含有有上述突变体基因的载体。本专利技术还提供了一种包含上述突变基因的人胚肾293细胞(冊K293细胞)。 本专利技术还提供了一种心脏钠通道蛋白突变体，其特征在于，心脏钠通道蛋白SCN5A的1180 位的氨基酸由丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。专利技术人经过大量的研究不仅专利技术了上述心脏钠通道SCN5A基因的新突变体，而且通过对 该突变进行功能分析，揭示了突变型钠通道SCN5AA1180V改变了正常心肌细胞内钠通道电流 的变化，从而引起心脏的结构改变，最终导致扩张型心肌病。本专利技术还提供了一种检测心脏钠通道SCN5A基因突变的方法，包括抽取外周静脉血并提 取白细胞DNA，其特征在于，(l)用序列表Seq. ID NO. 37和38作引物、PCR扩增模板DNA; (2)纯化PCR产物；和(3)按照本领域普通技术人员公知的技术进行测序，测序结果和Seq ID NO. 59比对，确认本专利技术的突变。专利技术人通过大量的实验证明，SCN5A基因A1180V突变是导致扩张型心肌病的致病基因 突变位点，因此，可制备相关的基因芯片或基因探测子等试剂盒，来早期诊断扩张型心肌病， 并选择作用于钠通道的药物来治疗这种类型的扩张型心肌病，有望延长该病患者的生存期和 改善生活质量。本专利技术为扩张型心肌病的早期诊断及新的治疗方案提供了一种新方法。 附图说明图l系SCN5A测序结果示1个新的杂合突变(C—T)，其位于Exon20，碱基的变异造成 了编码氨基酸的改变，在1180位置丙氨酸由缬氨酸代替(A1180V)。 II-l，家系患病成员之 一；WT，正常人。图2系野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的电流一电压(I一V)关系比较。图3系野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的激活期达峰时间比较。图4野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的激活期和失活期的Boltzmann分布曲线。半激活期的电压及斜率WT-35. 5±1.4 mV禾口 5.6 ±0.4 (n=13); A1180V -34.1士1.8mV和5.8±0. 3 (n=15)。半失活期的电压及斜率WT - 78. 7± 1. 3 mV和-5. 3±0. 2 (n=26);A1180V - 83. 1±1. 6 mV和-5. 4±0. 3 (n=31) 。 *, WT和A1180V的半失活期的电压差别有统计学意义。图5系野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的延迟时间常数一电压曲线。图6野生型(WT)和突变型(A1180V)通道在去极化脉冲250ms的迟发电流比较。突 变型通道没有完全失活，而是存在轻度增加的迟发电流；*， p<0.05。图7野生型(WT)和突变型(A1180V)通道失活后的恢复期比较。图A，突变型通道恢 复更慢，在一120， 一100和一80mV的电压下均如此；图B，恢复期时间常数和幅度；*， p〈0. 05。图8野生型(WT)和突变型(A1180V)通道的速率依赖性变化比较。图A，连续30次去 极化脉冲刺激后的钠电流变化，只标出了第1次和第30次的电流，重复刺激的脉冲速率为 4Hz;图B，每次脉冲刺激后钠电流峰值的描记点；图C，重复刺激的脉冲速率和钠电流峰值 变化的关系曲线，钠电流峰值的变化用第30次钠电流峰值和第1次钠电流峰值之比表示(Wllst); *， p〈0.05。 具体实施例方式以下结合具体实施方式进一步说明本专利技术，所有的实验条件及操作除有特殊说明外，按 照本领域普通技术人员所公知的技术或者按照厂家提供的说明书进行。实施例1扩张型心肌病家系中SCN5A基因的一个新突变A1180V一、 实验材料1. 抗凝剂10% EDTA. 2K的配置10g EDTA. 2K加入100ml双蒸水中。2. 红细胞裂解液配方2M Tris-HC1(PH 7.8) 2. 5ml, 1M MgCl2 2.5ml， 3M NaCl 1.6ml，加 双蒸水至500ml。3. 白细胞裂解液配方2MTris-HCl (PH 8. 0) 0. 25ml， 0. 4M EDTA (PH 8. 0) 1.25ml, 10%SDS 1.0ml, 3M NaCl 0. 85ml,加双蒸水至50ml。4. 2M Tris-HCl (PH 7. 8):称48. 4g Tris溶解在200ml双蒸水中，浓盐酸调PH至7. 8.5. 1M MgCl2: 41g MgCl2加入200ml水中。6. 3M NaCl: 35g NaCl加入200ml水中。7. TE: 10mM Tris-HCl (PH 8.0)， ImM EDTA (PH 8.0)配制。8. T叫酶由上海生物工程技术服务公司提供。9. PCR产物纯化试剂盒(上海生工)；DNA测序试剂盒(ABI公司)。10. PCR仪美国PTC — IOO型扩增仪。11. 测序仪美国ABI377型测序仪。二、 实验过程1患病家系临床资料与静脉血的收集中国山东一个伴进行性心脏传导障碍的扩张型心肌病家系，共调查该家系成员32人，其中与先证者有直系亲缘关系的成员24人。对家系成员仔细询问病史、体格检查、记录同步12导联心电图。对健在的家系成员均抽取外周静脉血5mL，加入O. 3ml 10% EDTA. 2K抗凝处理，反复摇本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种心脏钠通道基因ＳＣＮ５Ａ的新的突变体，其特征在于，如序列表Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ．５９的外显子２０（Ｅｘｏｎ２０）的１２８位的ｇ突变为ａ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱军，徐磊，葛均波，范铮，王克强，邹云增，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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